生化實驗講義(理論部分)二－－生物大分子的制備（二）

上一篇 / 下一篇 2008-09-26 12:11:15/ 個人分類：生化檢驗

2.3.2 透析

自Thomas Graham 1861年發明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質和濃縮樣品等都要用到透析的技術。

透析只需要使用專用的半透膜即可完成。通常是將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品溶液置入袋內，將此透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內，而鹽和小分子物質不斷擴散透析到袋外，直到袋內外兩邊的濃度達到平衡為止。保留在透析袋內未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋(膜)外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。

透析的動力是擴散壓，擴散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶質在膜內外兩邊的濃度梯度，還正比于膜的面積和溫度，通常是4℃透析，升高溫度可加快透析速度。

透析膜可用動物膜和玻璃紙等，但用的最多的還是用纖維素制成的透析膜，目前常用的是美國Union Carbide (聯合碳化物公司)和美國光譜醫學公司生產的各種尺寸的透析管，截留分子量MwCO(即留在透析袋內的生物大分子的最小分子量，縮寫為MwCO)通常為1萬左右。

商品透析袋制成管狀，其扁平寬度為23 mm～50 mm不等。為防干裂，出廠時都用10%的甘油處理過，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質，它們對蛋白質和其它生物活性物質有害，用前必須除去。可先用50%乙醇煮沸1小時，再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氫鈉和0.001 mol/L EDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。實驗證明，50%乙醇處理對除去具有紫外吸收的雜質特別有效。使用后的透析袋洗凈后可存于4℃蒸餾水中，若長時間不用，可加少量NaN2，以防長菌。洗凈涼干的透析袋彎折時易裂口，用時必須仔細檢查，不漏時方可重復使用。

新透析袋如不作如上的特殊處理，則可用沸水煮五至十分鐘，再用蒸餾水洗凈，即可使用。使用時，一端用橡皮筋或線繩扎緊，也可以使用特制的透析袋夾夾緊，由另一端灌滿水，用手指稍加壓，檢查不漏，方可裝入待透析液，通常要留三分之一至一半的空間，以防透析過程中，透析的小分子量較大時，袋外的水和緩沖液過量進入袋內將袋漲破。含鹽量很高的蛋白質溶液透析過夜時，體積增加50%是正常的。為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還可使用磁子攪拌。透析的容器要大一些，可以使用大燒杯、大量筒和塑料桶。小量體積溶液的透析，可在袋內放一截兩頭燒園的玻璃棒或兩端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。

檢查透析效果的方法是：用1% BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1% AgNO3 檢查NaCl、KCl等。

為了提高透析效率，還可以使用各種透析裝置。使用者也可以自行設計與制作各種簡易的透析裝置。美國生物醫學公司(Biomed Instruments Inc.)生產的各種型號的Zeineh 透析器，由于使用對流透析的原理，使透析速度和效率大大提高。

2.3.3 超濾

超過濾即超濾，自20年代問世后，直至60年代以來發展迅速，很快由實驗室規模的分離手段發展成重要的工業單元操作技術。超濾現已成為一種重要的生化實驗技術，廣泛用于含有各種小分子溶質的各種生物大分子(如蛋白質、酶、核酸等)的濃縮、分離和純化。

超濾是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到了部分的純化。

超濾根據所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。微孔過濾所用的操作壓通常小于4×104 Pa，膜的平均孔徑為500埃～14微米(1微米=104埃)，用于分離較大的微粒、細菌和污染物等。超濾所用操作壓為4×104 Pa～7×105 Pa，膜的平均孔徑為10—100埃，用于分離大分子溶質。反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到35×105 Pa～140×105 Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用于分離小分子溶質，如海水脫鹽，制高純水等。

超濾技術的優點是操作簡便，成本低廉，不需增加任何化學試劑，尤其是超濾技術的實驗條件溫和，與蒸發、冰凍干燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。

在生物大分子的制備技術中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。

超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制劑。對于蛋白質溶液，一般只能得到10～50%的濃度。

超濾技術的關鍵是膜。膜有各種不同的類型和規格，可根據工作的需要來選用。早期的膜是各向同性的均勻膜，即現在常用的微孔薄膜，其孔徑通常是0.05?m 和0.025?m。近幾年來生產了一些各向異性的不對稱超濾膜，其中一種各向異性擴散膜是由一層非常薄的、具有一定孔徑的多孔“皮膚層”(厚約0.1?m ～1.0?m )，和一層相對厚得多的(約1?m )更易通滲的、作為支撐用的“海綿層”組成。皮膚層決定了膜的選擇性，而海綿層增加了機械強度。由于皮膚層非常薄，因此高效、通透性好、流量大，且不易被溶質阻塞而導致流速下降。常用的膜一般是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物制成。近年來為適應制藥和食品工業上滅菌的需要，發展了非纖維型的各向異性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH 1～14都是穩定的，且能在90℃下正常工作。超濾膜通常是比較穩定的，若使用恰當，能連續用1～2年。暫時不用，可浸在1%甲醛溶液或0.2% 疊氮化鈉NaN3中保存。

超濾膜的基本性能指標主要有：水通量(cm3/(cm2?h));截留率(以百分率%表示);化學物理穩定性(包括機械強度)等。

超濾裝置一般由若干超濾組件構成。通常可分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。由于超濾法處理的液體多數是含有水溶性生物大分子、有機膠體、多糖及微生物等。這些物質極易粘附和沉積于膜表面上，造成嚴重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關鍵的問題，要克服濃差極化，通常可加大液體流量，加強湍流和加強攪拌。

國外生產超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國的Milipore公司和德國的Sartorius公司。國內主要的研究機構和生產廠家是：中科院生態環境研究中心、杭州淡化和水處理開發中心、蘭州膜科學技術研究所、無錫化工研究所、上海醫藥工業研究所、天津膜分離工程研究所、北京化工廠、常熟膜分離實驗廠、無錫市超濾設備廠、無錫純水設備廠、天津超濾設備廠、湖北沙市水處理設備廠等。從膜的品種，以及從某些研究工作的深度方面看，我國與世畀先進國家的差距不很大，但在膜的質量性能及商品化方面尚有較大差距。

在生物制品中應用超濾法有很高的經濟效益，例如供靜脈注射的25%人胎盤血白蛋白(即胎白)通常是用硫酸銨鹽析法、透析脫鹽、真空濃縮等工藝制備的，該工藝流程硫酸銨耗量大，能源消耗多，操詐時間長，透析過程易產生污染。改用超濾工藝后，平均回收率可達97.18%;吸附損失為1.69%;透過損失為1.23%;截留率為98.77%。大幅度提高了白蛋白的產量和質量，每年可節省硫酸銨6.2噸，自來水16000噸。

超濾技術的應用有很好的前景，應引起足夠的重視。

2.3.4 冰凍干燥

冰凍干燥機是生化與分子生物學實驗室必備的儀器之一，因為大多數生物大分子分離純化后的最終產品多數是水溶液，要從水溶液中得到固體產品，最好的辦法就是冰凍干燥，因為生物大分子容易失活，通常不能使用加熱蒸發濃縮的方法。

冰凍干燥是先將生物大分子的水溶液冰凍，然后在低溫和高真空下使冰升華，留下固體干粉。

冰凍干燥得到的生物大分子固體樣品有突出的優點：①由于是由冰凍狀態直接升華為汽態，所以樣品不起泡，不暴沸。②得到的干粉樣品不粘壁，易取出。③冰干后的樣品是疏松的粉末，易溶于水。

冰凍干燥特別適用于那些對熱敏感、易吸濕、易氧化及溶劑蒸發時易產生泡沫而引起變性的生物大分子，如蛋白質、酶、核酸、抗菌素和激素等。對于極個別的在凍干時易變性失活的生物大分子則要十分謹慎，務必先做小量試驗證明凍干無害后方可進行大量處理。

冰凍干燥機的國產品牌近年來發展很快。如北京的軍事醫學科學院生產的小型、中型和大型工業用冰干機，已可以取代昂貴的進口產品。在實驗室中還可以自已組裝小型簡易的冰凍干燥器。①準備一個較大的玻璃真空干燥器，將樣品置于小培養皿中速凍后放入干燥器內，器內已事先用兩個小培養皿分別盛有KOH(或NaOH) 和 P2O5，干燥器通過一個兩端塞上棉花其中裝滿P2O5的干燥管與真空泵相連，抽真空后，經過5～10小時就可以得到冰凍干燥的樣品。②將樣品溶液置于一個園底燒并內，將燒并浸入干冰～乙醇低溫浴(-60℃)中，樣品即被速凍成冰塊，將燒并標準磨口通過磨口管與一個冷阱相連，冷阱內放有干冰～乙醇混合液，冷阱的另一個出口管與真空泵相連，抽真空時汽化的水汽就凍結在冷阱的內壁上，抽真空數小時后即可在燒并中得到凍干的樣品。此簡易裝置也可用于凍干含有少量乙醇、甲醇、丙酮等常用有機溶劑的樣品，可重復以下的操作除去這些有機溶劑：樣品速凍→→抽真空至恒定→→使樣品升溫至室溫揮發有機溶劑→→再速凍樣品，如此反復多次，以除盡有機溶劑，否則樣品不易凍干，且泵前應裝有保護真空泵的緩沖并，以吸收水份和有機溶劑。

⑴樣品溶液：①樣品要溶于水，不含有機溶劑，否則會造成冰點降低，冰凍的樣品容易融化，因而減壓時會起大量泡沫，使樣品變性、污染和損失。同時若含有有機溶劑，被抽入真空泵后溶于真空泵油，使其可達真空度降低而必須換油。②樣品要予先脫鹽，不可使鹽濃度過高，否則冰凍后易融化，影響樣品活性，而且不易凍干。③樣品緩沖液在冰凍時pH可能會有較大變化，例如pH 7.0的磷酸鹽緩沖液在冰凍時，磷酸氫二鈉比磷酸二氫鈉先凍結，因而使溶液pH下降而接近3.5，使某些對低pH敏感的酶變性失活，此時需加入pH穩定劑，如糖類和鈣離子等。④樣品溶液的濃度不要過稀，例如蛋白質的濃度不低于15 mg/mL 為宜。同批凍干的樣品液濃度不宜相差太大，以免凍干的時間相差過大。

⑵裝樣品溶液的容器：①最好用各種尺寸的培養皿盛樣品溶液，液層不要太厚，以免凍干時間太長，耗電太多。也可以使用安瓿并和青霉素小并。用燒杯時液層厚度不要超過2 cm，否則燒杯易凍裂。②凍干稀溶液時會得到很輕的絨毛狀固體樣品，容易飛散而損失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水紙包住杯口，刺的孔不要過小過少，否則會影響凍干速度。

⑶溶液冰凍：如有條件，盡可能用干冰～乙醇低溫浴速凍，如能將盛有樣品溶液的容器邊凍邊旋轉形成很薄的冰凍層，則可以大大加快凍干的速度。

⑷凍干：①樣品全部凍干前，不要輕易搖動，以防水蒸汽沖散凍干的樣品粉末。②樣品凍干達到較高真空度時，容器外部有時會結霜，若外霜消失，則說明樣品已凍干，或是僅剩樣品中心的小冰塊，再稍加延長凍干時間即可。③凍干后要及時取出樣品，以免樣品在室溫下仃留時間過長而失活。④仃真空泵時要先放氣，以免泵油倒灌。放氣時要緩慢，以免氣流沖散樣品干粉。⑤樣品凍干后要及時密封冷藏，以防受潮。⑥真空泵要經常檢查油面和油色，油面過低和油色發黑，則需換油，通常半年或一季度至少要換一次油。

2.3.5 樣品的保存

生物大分子制成品的正確保存極為重要，一旦保存不當，辛辛苦苦制成的樣品失活、變性、變質，使前面的全部制備工作化為烏有，損失慘重，全功盡棄。

影響生物大分子樣品保存的主要因素有：

⑴空氣：空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動氧化。空氣中微生物的污染可使樣品腐敗變質，樣品吸濕后會引起潮解變性，同時也為微生物污染提供了有利的條件。某些樣品與空氣中的氧接觸會自發引起游離基鏈式反應，還原性強的樣品易氧化變質和失活，如維生素C、巰基酶等。

⑵溫度：每種生物大分子都有其穩定的溫度范圍，溫度升高10℃，氧化反應約加快數倍，酶促反應增加1～3倍。因此通常絕大多數樣品都是低溫保存，以抑制氧化、水解等化學反應和微生物的生成。

⑶水份：包括樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。水可以參加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。

⑷光線：某些生物大分子可以吸收一定波長的光，使分子活化不利于樣品保存，尤其日光中的紫外線能量大，對生物大分子制品影響最大，樣品受光催化的反應有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。因此樣品通常都要避光保存。

⑸樣品的pH：保存液態樣品時注意其穩定的pH范圍，通常可從文獻和手冊中查得或做實驗求得，因此正確選擇保存液態樣品的緩沖劑的種類和濃度就十分重要。

⑹時間：生化和分子生物學樣品不可能永久存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理。

現以保存蛋白質和酶為例：

⑴低溫下保存：由于多數蛋白質和酶對熱敏感，通常35℃～40℃以上就會失活，冷藏于冰箱一般只能保存一周左右，而且蛋白質和酶越純越不穩定，溶液狀態比固態更不穩定。因此通常要保存于-5℃～-20℃，如能在-70℃下保存則最為理想。極少數酶可以耐熱：如核糖核酸酶可以短時煮沸;胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90℃;蔗糖酶在50℃～60℃可以保持15 min～30 min不失活。還有少數酶對低溫敏感，如鳥肝丙酮酸羧化酶25℃穩定，低溫下失活，過氧化氫酶要在0℃～4℃保存，冰凍則失活，羧肽酶反復凍融會失活等。

⑵制成干粉或結晶保存：蛋白質和酶固態比在溶液中要穩定的多。固態干粉制劑放在干燥劑中可長期保存，例如葡萄糖氧化酶干粉0℃下可保存2年，-15℃下可保存8年。通常，酶與蛋白質含水量大于10%，室溫低溫下均易失活，含水量小于5%時，37℃活性會下降，如要抑制微生物活性，含水量要小于10%，抑制化學活性，含水量要小于3%。此外要特別注意酶在凍干時往往會部分失活。

⑶在保護劑下保存：很早就有人觀察到，在無菌條件下，室溫保存了45年的血液，血紅蛋白僅有少量改變，許多酶仍保留部分活性，這是因為血液中有蛋白質穩定的因素，為了長期保存蛋白質和酶，常常要加入某些穩定劑：例如：①惰性的生化或有機物質：如糖類、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持穩定的疏水環境。②中性鹽：有一些蛋白質要求在高離子強度(1 mol/L～4mol/L或飽和的鹽溶液)的極性環境中才能保持活性。最常用的是：MgSO4、NaCl、(NH4)SO4等。使用時要脫鹽。③巰基試劑：一些蛋白質和酶的表面或內部含有半胱氨酸巰基，易被空氣中的氧緩饅氧化為磺酸或二硫化物而變性，保存時可加入半胱氨酸或巰基乙醇。

總之，對樣品的保存必須給以只夠的重視，一些常用酶的保存條件可參見《生物化學制備技術》(蘇拔賢主編)一書中的“一些酶保存的條件和穩定性”表，其他各種生物大分子和生物制劑的保存條件，可查閱有關的文獻和酶學手冊。

2.3.6 分離純化方法的選擇

生物大分子能否高效率地制備成功，關鍵在于分離純化方案的正確選擇和各個分離純化方法實驗條件的探索。選擇與探索的依據就是生物大分子與雜質之間的生物學和物理化學性質上的差異。由本章前述的生物大分子制備的各種特點可以看出，分離純化方案必然是千變萬化的。

制備生物大分子的方法可以粗略地分類如下：① 以分子大小和形態的差異為依據的方法：差速離心、區帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。② 以溶解度的差異為依據的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結晶等。③ 以電荷差異為依據的方法：電泳、電滲析、等電點沉淀、吸附層析和離子交換層析等。④ 以生物學功能專一性為依據的方法：親和層析等。

在分離純化流程中，早期和晚期的分離純化方法的選擇有明顯的不同：

⑴ 早期分離純化

1) 特點：①粗提取液中物質成份十分復雜。②欲制備的生物大分子濃度很稀。

③物理化學性質相近的物質很多。④希望能除去大部分與目的產物物理化學性質差異大的雜質。

2) 對所選方法的要求：①要快速、粗放。②能較大地縮小體積。③分辨力不必太高。④負荷能力要大。

3) 可選用的方法：吸附;萃取;沉淀法(熱變性、鹽析、有機溶劑沉淀等);離子交換(批量吸附、胖柱交換);親和層析等。

⑵晚期分離純化

1) 可選用的方法：吸附層析、鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備HPLC等。

2)要注意的一些問題：

①鹽析后要及時脫鹽。

②用凝膠過濾時如何縮小上樣體積，因為凝膠層析柱的上樣體積只能是柱床體積的1/10～1/6，也可以使用串聯柱以加大柱床體積。

③必要時也可以重復使用同一種分離純化方法，例如分級有機溶劑沉淀，分級鹽析，連續兩次凝膠過濾或離子交換層析等。