生化實驗講義(理論部分)二－－生物大分子的制備（一）

2.1 概述

生物大分子主要是指蛋白質、酶(也是一種蛋白質)和核酸，這三類物質是生命活動的物質基礎。在自然科學，尤其是生命科學高度發展的今天，蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結構與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，沒有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結構與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細致而困難的工作，有時制備一種高純度的蛋白質、酶或核酸，要付出長期和艱苦的努力。

與化學產品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點：

⑴生物材料的組成極其復雜，常常包含有數百種乃至幾千種化合物。其中許多化合物至今還是個謎，有待人們研究與開發。有的生物大分子在分離過程中還在不斷的代謝，所以生物大分子的分離純化方法差別極大，想找到一種適合各種生物大分子分離制備的標準方法是不可能的。

⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，只有萬分之一、幾十萬分之一，甚至幾百萬分之一。分離純化的步驟繁多，流程又長，有的目的產物要經過十幾步、幾十步的操作才能達到所需純度的要求。例如由腦垂體組織取得某些激素的釋放因子，要用幾噸甚至幾十噸的生物材料，才能提取出幾毫克的樣品。

⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。過酸、過堿、高溫、劇烈的攪拌、強輻射及本身的自溶等都會使生物大分子變性而失活，所以分離純化時一定要選用最適宜的環境和條件。

⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷，因而實驗結果常有很大的經驗成份，實驗的重復性較差，個人的實驗技術水平和經驗對實驗結果會有較大的影響。

由于生物大分子的分離和制備是如此的復雜和困難，因而實驗方法和流程的設計就必須盡可能多查文獻，多參照前人所作的工作，吸取其經驗和精華，探索中的失敗和反復是不可避免的，只有具有百折不撓的鉆研精神才能達到預期的目的。

生物大分子的制備通常可按以下步驟進行：①確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進行科研、開發還是要發現新的物質。②建立相應的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關鍵，因為它是整個分離純化過程的“眼睛”。③通過文獻調研和預備性實驗，掌握生物大分子目的產物的物理化學性質。④生物材料的破碎和預處理。⑤分離純化方案的選擇和探索，這是最困難的過程。⑥生物大分子制備物的均一性(即純度)的鑒定，要求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLC和毛細管電泳都是一個峰。⑦產物的濃縮，干燥和保存。

分析測定的方法主要有兩類：即生物學和物理、化學的測定方法。生物學的測定法主要有酶的各種測活方法、蛋白質含量的各種測定法、免疫化學方法、放射性同位素示蹤法等;物理、化學方法主要有比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法(紫外/可見、紅外和熒光等分光光度法)、電泳法、以及核磁共振等。實際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測定更加快速、簡便。

生物大分子制備物的均一性(即純度)的鑒定，通常只采用一種方法是不夠的，必須同時采用2～3種不同的純度鑒定法才能確定。蛋白質和酶制成品純度的鑒定最常用的方法是：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳，如能再用高效液相色譜(HPLC)和毛細管電泳(CE)進行聯合鑒定則更為理想，必要時再做N-末端氨基酸殘基的分析鑒定，過去曾用的溶解度法和高速離心沉降法，現已很少再用。核酸的純度鑒定通常采用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，但最方便的還是紫外吸收法，即測定樣品在pH 7.0時260nm與280nm的吸光度(A260和A280)，從A260/A280的比值即可判斷核酸樣品的純度。

要了解的生物大分子的物理、化學性質主要有：①在水和各種有機溶劑中的溶解性。②在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩定性。③固態時對溫度、含水量和凍干時的穩定性。④各種物理性質：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數等。⑤其他化學性質：如對各種蛋白酶、水解酶的穩定性和對各種化學試劑的穩定性。⑥對其他生物分子的特殊親和力等。

制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。各種方法的基本原理基本上可以歸納為兩個方面：一是利用混合物中幾個組分分配系數的差異，把它們分配到兩個或幾個相中，如鹽析、有機溶劑沉淀、層析和結晶等;二是將混合物置于某一物相(大多數是液相)中，通過物理力場的作用，使各組分分配于不同的區域，從而達到分離的目的，如電泳、離心、超濾等，目前純化蛋白質等生物大分子的關鍵技術是電泳、層析和高速與超速離心。由于生物大分子不能加熱熔化和汽化，因而所能分配的物相只限于固相和液相，在此兩相之間交替進行分離純化。在實際工作中往往要綜合運用多種方法，才能制備出高純度的生物大分子。

純化生物大分子總是希望純度和產率都要高。例如純化某種酶，理想的結果是比活力和總回收率都要高才好，但實際上兩者不能兼得，通常在科研上希望比活力盡可能的高，而犧牲一些回收率，在工業生產上則正相反。

2.2 生物大分子制備的前處理

2.2.1 生物材料的選擇

制備生物大分子，首先要選擇適當的生物材料。材料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產物。從工業生產角度選擇材料，應選擇含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低的原料，但往往這幾方面的要求不能同時具備，含量豐富但來源困難，或含量來源較理想，但材料的分離純化方法繁瑣，流程很長，反倒不如含量低些但易于獲得純品的材料，由此可見，必須根據具體情況，抓住主要矛盾決定取舍。從科研工作的角度選材，則只須考慮材料的選擇符合實驗預定的目標要求即可。除此之外，選材還應注意植物的季節性、地理位置和生長環境等。選動物材料時要注意其年齡、性別、營養狀況、遺傳素質和生理狀態等。動物在饑餓時，脂類和糖類含量相對減少，有利于生物大分子的提取分離。選微生物材料時要注意菌種的代數和培養基成分等之間的差異，例如在微生物的對數期，酶和核酸的含量較高，可獲得較高的產量。

材料選定后要盡可能保持新鮮，盡快加工處理，動物組織要先除去結締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當的溶劑中提取，如果所要求的成分在細胞內，則要先破碎細胞。植物要先去殼、除脂。微生物材料要及時將菌體與發酵液分開。生物材料如暫不提取，應冰凍保存。動物材料則需深度冷凍保存。

2.2.2 細胞的破碎

除了某些細胞外的多肽激素和某些蛋白質與酶以外，對于細胞內或多細胞生物組織中的各種生物大分子的分離純化，都需要事先將細胞和組織破碎，使生物大分子充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的細胞破碎方法。

(1)機械法：

1) 研磨：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，即可將動物細胞破碎，這種方法比較溫和，適宜實驗室使用。工業生產中可用電磨研磨。細菌和植物組織細胞的破碎也可用此法。

2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎，為了防止發熱和升溫過高，通常是轉10秒～20秒，停10秒～20秒，可反復多次。

(2)物理法：

1) 反復凍融法：將待破碎的細胞冷至-15℃到-20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復凍融多次，由于細胞內形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。

2) 超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些，處理的效果與樣品濃度和使用頻率有關。使用時注意降溫，防止過熱。

3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高壓下使幾十毫升的細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。這是一種較理想的破碎細胞的方法，但儀器費用較高。

4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法。在90℃左右維持數分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。

(3)化學與生物化學方法：

1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當的溫度下，細胞結構在自身所具有的各種水解酶(如蛋白酶和酯酶等)的作用下發生溶解，使細胞內含物釋放出來，此法稱為自溶法。使用時要特別小心操作，因為水解酶不僅可以使細胞壁和膜破壞，同時也可能會把某些要提取的有效成分分解了。

2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內含物。

3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細胞壁分解，釋放出細胞內含物，此法適用于多種微生物。例如從某些細菌細胞提取質粒DNA時，可采用溶菌酶(來自蛋清)破細胞壁，而在破酵母細胞時，常采用蝸牛酶(來自蝸牛)，將酵母細胞懸于0.1mmol/L 檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液(pH=5.4)中，加1%蝸牛酶，在30℃處理30分鐘，即可使大部分細胞壁破裂，如同時加入0.2%疏基乙醇效果會更好。此法可以與研磨法聯合使用。

4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS(十二烷基硫酸鈉)等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯合使用。

2.2.3 生物大分子的提取

“提取”是在分離純化之前將經過預處理或破碎的細胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態不丟失生物活性的過程。這一過程是將目的產物與細胞中其他化合物和生物大分子分離，即由固相轉入液相，或從細胞內的生理狀況轉入外界特定的溶液中。

影響提取的因素主要有：目的產物在提取的溶劑中溶解度的大小;由固相擴散到液相的難易;溶劑的pH值和提取時間等。一種物質在某一溶劑中溶解度的大小與該物質的分子結構及使用的溶劑的理化性質有關。一般地說，極性物質易溶于極性溶劑，非極性物質易溶于非極性溶劑;堿性物質易溶于酸性溶劑，酸性物質易溶于堿性溶劑;溫度升高，溶解度加大，遠離等電點的pH值，溶解度增加。提取時所選擇的條件應有利于目的產物溶解度的增加和保持其生物活性。

⑴ 水溶液提取：

蛋白質和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質的穩定性好，溶解度大，是提取蛋白質和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應注意的幾個主要影響因素是：

1) 鹽濃度(即離子強度)：離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質，如DNA-蛋白復合物，在高離子強度下溶解度增加，而另一些物質，如RNA-蛋白復合物，在低離子強度下溶解度增加，在高離子強度下溶解度減小。絕大多數蛋白質和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質的溶解度比在純水時大大增加，稱為“鹽溶”現象。但中性鹽的濃度增加至一定時，蛋白質的溶解度又逐漸下降，直至沉淀析出，稱為“鹽析”現象。鹽溶現象的產生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，增加了溶質和溶劑分子間相互作用力的結果。所以低鹽溶液常用于大多數生化物質的提取。通常使用0.02 mol/L ～0.05 mol/L 緩沖液或0.09 mol/L ～0.15 mol/L NaCl 溶液提取蛋白質和酶。不同的蛋白質極性大小不同，為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度(如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4)可以增加溶液的極性。

2) pH值：蛋白質、酶與核酸的溶解度和穩定性與pH值有關。過酸、過堿均應盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內，提取溶劑的pH應在蛋白質和酶的穩定范圍內，通常選擇偏離等電點的兩側。堿性蛋白質選在偏酸一側，酸性蛋白質選在偏堿的一側，以增加蛋白質的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶為堿性蛋白質，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，則常用稀堿來提取。

3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質和酶，提取時一般在0℃～5℃的低溫操作。但少數對溫度耐受力強的蛋白質和酶，可提高溫度使雜蛋白變性，有利于提取和下一步的純化。

4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：在提取蛋白質、酶和核酸時，常常受自身存在的蛋白酶或核酸酶的降解作用而導致實驗的失敗。為防止這一現象的發生，常常采用加入抑制劑或調節提取液的pH、離子強度或極性等方法使這些水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質、酶及核酸的降解作用。例如在提取DNA時加入EDTA絡合DNAase活化所必須的Mg++。

5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質的變性失活。因為一般蛋白質都含有相當數量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內或分子間的二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。

⑵ 有機溶劑提取

一些和脂類結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性，其中正丁醇在0℃時在水中的溶解度為10.5%，40℃時為6.6%，同時又用具有較強的親脂性，因此常用來提取與脂結合較牢或含非極性側鏈較多的蛋白質、酶和脂類。例如植物種子中的玉蜀黍蛋白、麩蛋白，常用70%～80%的乙醇提取，動物組織中一些線粒體及微粒上的酶常用丁醇提取。

有些蛋白質和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機溶液提取常常可以防止水解酶的破壞，并兼有除去雜質提高純化效果的作用。例如，胰島素可溶于稀酸、稀堿和稀醇溶液，但在組織中與其共存的糜蛋白酶對胰島素有極高的水解活性，因而采用6.8%乙醇溶液并用草酸調溶液的pH為2.5～3.0，進行提取，這樣就從下面三個方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：①6.8%的乙醇可以使糜蛋白酶暫時失活;②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++;③選用pH2.5～3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。以上條件對胰島素的溶解和穩定性都沒有影響，卻可除去一部分在稀醇與稀酸中不溶解的雜蛋白。

2.3 生物大分子的分離純化

由于生物體的組成成分是如此復雜，數千種乃至上萬種生物分子又處于同一體系中，因此不可能有一個適合于各類分子的固定的分離程序，但多數分離工作關鍵部分的基本手段是相同的。為了避免盲目性，節省實驗探索時間，要認真參考和借鑒前人的經驗，少走彎路。常用的分離純化方法和技術有：沉淀法(包括：鹽析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀等)、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。本章以介紹沉淀法為主。

2.3.1 沉淀法

沉淀是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程。沉淀法(即溶解度法)操作簡便，成本低廉，不僅用于實驗室中，也用于某些生產目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法。通過沉淀，將目的生物大分子轉入固相沉淀或留在液相，而與雜質得到初步的分離。

此方法的基本原理是根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，不同溶解度的產生是由于溶質分子之間及溶質與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質和溶劑的化學性質及結構有關，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變溶液的pH值、離子強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改變。

在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是：

⑴中性鹽沉淀(鹽析法)：多用于各種蛋白質和酶的分離純化。

⑵有機溶劑沉淀：多用于蛋白質和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。

⑶選擇性沉淀(熱變性沉淀和酸堿變性沉淀)：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。

⑷等電點沉淀：用于氨基酸、蛋白質及其他兩性物質的沉淀，但此法單獨應用較少，多與其他方法結合使用。

⑸有機聚合物沉淀： 是發展較快的一種新方法， 主要使用PEG聚乙二醇(Polyethyene glycol)作為沉淀劑。

2.3.1.1 中性鹽沉淀(鹽析法)

在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離，20%～40%飽和度的硫酸銨可以使許多病毒沉淀，43%飽和度的硫酸銨可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。鹽析法應用最廣的還是在蛋白質領域，已有八十多年的歷史，其突出的優點是：①成本低，不需要特別昂貴的設備。②操作簡單、安全。③對許多生物活性物質具有穩定作用。

⑴ 中性鹽沉淀蛋白質的基本原理

蛋白質和酶均易溶于水，因為該分子的-COOH、-NH2和-OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質分子之間的作用力，蛋白質分子表面極性基團越多，水化層越厚，蛋白質分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩定因素有兩個：即電荷和水膜。因為中性鹽的親水性大于蛋白質和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質分子即形成沉淀。鹽析示意圖如下頁“圖2-1”所示。

⑵ 中性鹽的選擇

常用的中性鹽中最重要的是(NH4)2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優點：

① 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質通常是在低溫下穩定，因而鹽析操作也要求在低溫下(0～4℃)進行。

⑶ 鹽析的操作方法

最常用的是固體硫酸銨加入法。欲從較大體積的粗提取液中沉淀蛋白質時，往往使用固體硫酸銨，加入之前要先將其研成細粉不能有塊，要在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，尤其到接近計劃飽和度時，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應有的蛋白質沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時間，待沉淀完全后再離心與過濾。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法，因為高濃度硫酸銨密度太大，要使蛋白質完全沉降下來需要較高的離心速度和較長的離心時間。

各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。硫酸銨濃度的表示方法是以飽和溶液的百分數表示，稱為百分飽和度，而不用實際的克數或克分子數，這是由于當固體硫酸銨加到水溶液中去時，會出現相當大的非線性體積變化，計算濃度相當麻煩，為了克服這一困難，有人經過精心測量，確定出1升純水提高到不同濃度所需加入硫酸銨的量，附錄中的實驗數據以飽和濃度的百分數表示，使用時十分方便。

⑷ 鹽析曲線的制作

如果要分離一種新的蛋白質和酶，沒有文獻數據可以借鑒，則應先確定沉淀該物質的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下：

取已定量測定蛋白質或酶的活性與濃度的待分離樣品溶液，冷至0℃～5℃，調至該蛋白質穩定的pH值，分6～10次分別加入不同量的硫酸銨，第一次加硫酸銨至蛋白質溶液剛開始出現沉淀時，記下所加硫酸銨的量，這是鹽析曲線的起點。繼續加硫酸銨至溶液微微混濁時，靜止一段時間，離心得到第一個沉淀級分，然后取上清再加至混濁，離心得到第二個級分，如此連續可得到6～10個級分，按照每次加入硫酸銨的量，在附錄中查出相應的硫酸銨飽和度。將每一級分沉淀物分別溶解在一定體積的適宜的pH緩沖液中，測定其蛋白質含量和酶活力。以每個級分的蛋白質含量和酶活力對硫酸銨飽和度作圖，即可得到鹽析曲線。

⑸鹽析的影響因素

① 蛋白質的濃度：中性鹽沉淀蛋白質時，溶液中蛋白質的實際濃度對分離的效果有較大的影響。通常高濃度的蛋白質用稍低的硫酸銨飽和度即可將其沉淀下來，但若蛋白質濃度過高，則易產生各種蛋白質的共沉淀作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。對低濃度的蛋白質，要使用更大的硫酸銨飽和度，但共沉淀作用小，分離純化效果較好，但回收率會降低。通常認為比較適中的蛋白質濃度是2.5%～3.0%，相當于25 mg/mL～30mg/mL。

② pH值對鹽析的影響：蛋白質所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。改變pH值可改變蛋白質的帶電性質，因而就改變了蛋白質的溶解度。遠離等電點處溶解度大，在等電點處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質時，pH值常選在該蛋白質的等電點附近。

③ 溫度的影響：溫度是影響溶解度的重要因素，對于多數無機鹽和小分子有機物，溫度升高溶解度加大，但對于蛋白質、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質的溶解度大多數還是隨濃度升高而增加的。在一般情況下，對蛋白質鹽析的溫度要求不嚴格，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。2.3.1.2 有機溶劑沉淀法

⑴基本原理

有機溶劑對于許多蛋白質(酶)、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介電常數，溶劑的極性與其介電常數密切相關，極性越大，介電常數越大，如20℃時水的介電常數為80，而乙醇和丙酮的介電常數分別是24和21.4，因而向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，增加了蛋白質分子間的相互作用，導致蛋白質溶解度降低而沉淀。溶液介電常數的減少就意味著溶質分子異性電荷庫侖引力的增加，使帶電溶質分子更易互相吸引而凝集，從而發生沉淀。另一方面，由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質分子的水膜，因而發生沉淀作用。

有機溶劑沉淀法的優點是：①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉淀。②沉淀不用脫鹽，過濾比較容易(如有必要，可用透析袋脫有機溶劑)。因而在生化制備中有廣泛的應用。其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。

⑵有機溶劑的選擇和濃度的計算

用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。

進行沉淀操作時，欲使溶液達到一定的有機溶劑濃度，需要加入的有機溶劑的濃度和體積可按下式計算：

V = V0 (S2 -S1) /(100-S2)

式中：

V = 需加入100%濃度有機溶劑的體積

V0 = 原溶液體積

S1 = 原溶液中有機溶劑的濃度

S2 = 所要求達到的有機溶劑的濃度

100是指加入的有機溶劑濃度為100%，如所加入的有機溶劑的濃度為95%，上式的(100-S2) 項應改為 (95-S2) 。

上式的計算由于未考慮混溶后體積的變化和溶劑的揮發情況，實際上存在一定的誤差。有時為了獲得沉淀而不著重于進行分離，可用溶液體積的倍數：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉淀。

⑶有機溶劑沉淀的影響因素

① 溫度： 多數蛋白質在有機溶劑與水的混合液中，溶解度隨溫度降低而下降。值得注意的是大多數生物大分子如蛋白質、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產生放熱反應，因此有機溶劑必須預先冷至較低溫度，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。一般規律是溫度越低，得到的蛋白質活性越高。

②樣品濃度：樣品濃度對有機溶劑沉淀生物大分子的影響與鹽析的情況相似：低濃度樣品要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀，且樣品的損失較大，即回收率低，具有生物活性的樣品易產生稀釋變性。但對于低濃度的樣品，雜蛋白與樣品共沉淀的作用小，有利于提高分離效果。反之，對于高濃度的樣品，可以節省有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉淀作用大，分離效果下降。通常，使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質初濃度為宜，可以得到較好的沉淀分離效果。

③ pH值：有機溶劑沉淀適宜的pH值，要選擇在樣品穩定的pH值范圍內，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH值，通常是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。

④ 離子強度：離子強度是影響有機溶劑沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白質為例，鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常溶液中鹽濃度以不超過5%為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質水溶液的2倍體積為宜，少量的中性鹽對蛋白質變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質在水中的溶解度，降低了有機溶劑沉淀蛋白質的效果，通常是在低鹽或低濃度緩沖液中沉淀蛋白質。

有機溶劑沉淀法經常用于蛋白質、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分離，使用時先要選擇合適的有機溶劑，然后注意調整樣品的濃度、溫度、pH值和離子強度，使之達到最佳的分離效果。沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行下一步的分離，則應盡可能抽干沉淀，減少其中有機溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。

2.3.1.3 選擇性變性沉淀法

這一方法是利用蛋白質、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱為選擇性變性沉淀法。常用的有熱變性、選擇性酸堿變性和有機溶劑變性等。

⑴ 熱變性

利用生物大分子對熱的穩定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最為簡便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子的初期分離純化。

⑵ 表面活性劑和有機溶劑變性

不同蛋白質和酶等對于表面活性劑和有機溶劑的敏感性不同，在分離純化過程中使用它們可以使那些敏感性強的雜蛋白變性沉淀，而目的物仍留在溶液中。使用此法時通常都在冰浴或冷室中進行，以保護目的物的生物活性。

⑶ 選擇性酸堿變性

利用蛋白質和酶等對于溶液中酸堿不同pH值的穩定性不同而使雜蛋白變性沉淀，通常是在分離純化流程中附帶進行的一個分離純化步驟。

2.3.1.4 等電點沉淀法

等電點沉淀法是利用具有不同等電點的兩性電解質，在達到電中性時溶解度最低，易發生沉淀，從而實現分離的方法。氨基酸、蛋白質、酶和核酸都是兩性電解質，可以利用此法進行初步的沉淀分離。但是，由于許多蛋白質的等電點十分接近，而且帶有水膜的蛋白質等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，效果不理想，因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。

2.3.1.5 有機聚合物沉淀法

有機聚合物是六十年代發展起來的一類重要的沉淀劑，最早應用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。其中應用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n >4)( Polyethylene Glycol 簡寫為 PEG )，它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的 PEG。

PEG的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關，同時還受離子強度、溶液pH和溫度等因素的影響。在一定的pH值下，鹽濃度越高，所需PEG時濃度越低，溶液的pH越接近目的物的等電點，沉淀所需PEG的濃度越低。在一定范圍內，高分子量和濃度高的PEG沉淀的效率高。以上這些現象的理論解釋還都僅僅是假設，未得到充分的證實，其解釋主要有：①認為沉淀作用是聚合物與生物大分子發生共沉淀作用。②由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水而發生沉淀。③聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通過空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發生沉淀。

本方法的優點是：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當多的生物大分子。③沉淀后有機聚合物容易去除。