作者:保志娟，楊雪瓊，丁中濤，曹秋娥，鄒永明
摘要：使用pH=8.93的KH2PO4-NaOH緩沖液(0.025mol/L)，根據混合物含量測定的原理，在289.4nm和316.4nm處測定溶液吸光度來測定厚樸酚與和厚樸酚的含量，在517nm處考察厚樸酚與和厚樸酚清除DPPH·的活性，建立了同時測定厚樸酚與和厚樸酚含量的紫外分光光度法，初步考察了二者的自由基清除活性。DPPH·可作為二者抗氧化活性的研究方法。
厚樸酚(magnolo1)與和厚樸酚(honokio1)是木蘭科植物厚樸、大葉木蘭樹皮及洋玉蘭種子中的主要活性成分，廣泛地用于臨床治療，主要有肌肉松弛、抗菌、抗炎、抑制胃潰瘍和防止應激性胃功能障礙、抑制血小板聚集、中樞神經系統保護和降血壓等作用，最近的研究指出厚樸酚與和厚樸酚還具有抑制癌細胞的作用。目前用于定量測定厚樸酚與和厚樸酚的方法主要是薄層掃描法、高效液相色譜法和毛細管區帶電泳法。用紫外分光光度法同時分別測定厚樸酚及和厚樸酚尚未見報道。
在中性溶液中，厚樸酚與和厚樸酚的紫外吸收基本一致。本文利用它們羥基質子離解性(pKa)的差異 ，在一定濃度的樣品液中加入緩沖溶液，使厚樸酚離解而和厚樸酚不離解，從而使厚樸酚的最大吸收峰發生紅移，這樣二者的最大吸收峰不再重合。在含有多種吸光物質的溶液中，由于各吸光物質對某一波長的單色光均有吸收作用，如果各吸光物質的吸光質點之間相互不發生化學反應，當某一波長的單色光通過這樣一種含多種吸光物質的溶液時，溶液的總吸光度應等于各吸光物質的吸光度之和。據此，可以進行多組分的分析測定。對于二元組分混合物的分別測定，可解聯立方程式。由此建立了厚樸酚與和厚樸酚同時測定的紫外分光光度法，并應用于三種中成藥：香砂平胃散、藿香正氣水和保劑丸中厚樸酚及和厚樸酚的含量測定。同時還研究了厚樸酚與和厚樸酚清除DPPH·的活性。
1 儀器與試劑
UV-PC-2401型紫外分光光度儀(日本島津公司)，pHS-2C型精密pH計。厚樸酚及和厚樸酚純品(從長緣厚樸中分離得到，HPLC純化)，無水乙醇、KH2PO4、NH4Cl、NaOH、Na2B4O7.10H20均為分析純試劑，香砂平胃散((昆明天紫紅制藥廠)、藿香正氣水(云南騰沖制藥廠)、保劑丸(廣州羊城藥業股份有限公司)均為市售藥品。
標準溶液：取厚樸酚與和厚樸酚純品，50%乙醇及無水乙醇分別配制成1.00×10mol/L的溶液。
DPPH·(1，1-Dipheny1-2-piclhydrazyl radica1)(日本東京化成工業株氏會社)，用無水乙醇(國產A.R.級試劑)為溶劑，超聲溶解后，將其配制成濃度為2.00×0.0001mol/L的儲備液，密封于冰箱存放，用時將儲備液稀釋。
2 樣品處理方法
參照文獻5對藥品進行處理。準確稱取香砂平胃散8.0600 g，加入25mL無水乙醇回流1.5 h，冷卻至室溫過濾，沉淀用少量無水乙醇洗滌后再過濾，濾液合并蒸干。殘渣用7mL Na0H(1mol/L)溶解，用20mL石油醚萃取兩次。水層用Ha調pH=2～3，用30，30，20，20，20mL CHCl3萃取，用蒸餾水20mL清洗CHCI3萃取液至中性，水層再用20mL CHCl3萃取，合并CHCl3層用無水Na2SO4干燥后蒸干。殘渣用無水乙醇溶解定容至25mL，再精密吸取1.0 mL該液用50%乙醇定容為25mL，濾膜過濾后作為無色待測液。
保劑丸(粉末2.0067g)和藿香正氣水(10mL)的處理方法與香砂平胃散類似，只是保劑丸殘渣直接用50%乙醇定容為100mL，再精密吸取15.0mL定容為25mL過濾待用;藿香正氣水則不需回流，加熱先除去乙醇后，再按前述方法處理，直接用50%乙醇液定容至25mL過濾待用。
3 方法與結果
3.1 緩沖體系及用量選擇 ，
配制不同pH值的Na2B407-HCl、KH2PO4-NaOH、NHCl-NH3·H2O緩沖液。分別取厚樸酚標液2.5 mL，加入上述緩沖液各5.0 mL，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，以蒸餾水為參比進行UV測定。由于KH2PO4-NaOH體系的干擾小，且樣品峰型好，故實驗選擇該緩沖體系。其它條件不變，改變緩沖液用量，結果表明用量在4.0～8.0 mL間吸光度穩定且峰形良好，故選擇合適體積為5.0 mL。
3.2 測定pH值的選擇
取5mL相同濃度不同pH值的KH2PO4-NaOH緩沖液，加入厚樸酚或和厚樸酚標液2.5mL定容為25mL，測定最大吸收峰。結果顯示在pH值8.08～9.44范圍內，厚樸酚已經離解，其最大吸收峰紅移到316.4nm，而和厚樸酚還未離解，其最大吸收峰還在289.4nm處，故我們選擇pH=8.93的KH2PO4-NaOH緩沖液。
3.3 穩定性研究及乙醇用量影響
厚樸酚及和厚樸酚標液各取2.5mL，加入pH=8.93的KH2PO4-NaOH緩沖液5.0 mL，定容至25mL，放置5，10，30min，1h，2h測定最大吸收峰的吸光度。結果顯示放置時間超過2h后，吸光度略有下降，在1h內，樣品穩定，吸光度幾乎不變。由于在標樣及試樣溶液中，用到了無水乙醇，為此考察了乙醇用量的影響。從測定結果看，加入乙醇會增加吸光度，但增加的量很小，考慮到乙醇的揮發性，故不加入更多的乙醇，以防止測定誤差增大。
3.4 標準曲線
精度取厚樸酚及和厚樸酚標液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL于25mL比色管中，加入pH=8.93的KH2PO4-NaOH緩沖液5.0mL，蒸餾水定容為25mL，在289.4nm，316.4nm的波長下測定吸光度。以吸光度值A對濃度C進行線性回歸(SPSS軟件計算)，厚樸酚的標準曲線為A316.4=7500.000C+0.08529(R=0.999，RSD=0.00748)，A289.4=4221.429C+0.103(R=1.000，RSD=0.00362)。和厚樸酚的標準曲線為A316.4=666.071C+0.07589(R=0.998，RSD=0.00155)，A289.4=6939.286C+0.106(R=1.000，RSD=0.00536)。厚樸酚及和厚樸酚在1.00×0.00001～3.00×0.0001mol/L(2.667～79.8μg/mL)范圍內呈線性關系。
3.5 樣品測定方法和可行性
分別取香砂平胃散待測液1.5 mL，藿香正氣水、保劑丸待測液1mL，加入5mL pH=8.93的KH2PO4-NaOH緩沖液5mL，定容為25mL，平行測定三次，求樣品含量。并按照3.6項下方法求算回收率。由標準溶液可求出厚樸酚與和厚樸酚在316.4m和289.4nm處的摩爾吸光系數ε，根據A316 4(總)= ε316.4(厚樸酚)·C(厚樸酚)+ ε316.4(和厚樸酚)·C(和厚樸酚)A289. 4(總)= ε289.4(厚樸酚)·C(厚樸酚)+ ε289.4(和厚樸酚)·C(和厚樸酚)可計算出厚樸酚與和厚樸酚的含量。
在一份溶液中加入與樣品含量相近的厚樸酚與和厚樸酚純品，掃描紫外圖譜。結果顯示，在270nm～350 nm范圍內，厚樸酚與和厚樸酚純品混合液與樣品的紫外吸收的峰形相似，且吸光度相近。因而可判斷樣品用該法測定是可行的，樣品中的其它物質在測定條件下基本不干擾。
3.6 加樣回收率
取已知濃度5份待測液加入1.0 mL厚樸酚及0.5 mL和厚樸酚標液，另外一份做空白。各份按照標準樣品測定的方法，加入緩沖液并定容到25mL，在289.4，316.4 rim處測定吸光度，求均值，計算相對加樣回收率。
3.7 活性研究
1，1-二苯基-2-苦味肼基自由基(DPPH·)法可作為初步抗氧化活性研究。DPPH·的乙醇溶液為深紫色，其最大波長在517nm處。當加入清除活性物質，DPPH·的溶液將會褪色。其褪色程度與自由基清除劑的含量成化學計量關系，可用分光光度法進行測定。我們取2.0 mL DPPH·溶液，加入不同體積的厚樸酚與和厚樸酚無水乙醇溶液，用無水乙醇定容為5mL，放置30min后，在517nm處，迅速測定A517根據公式計算其抑制率。抑制率=[( A0一Ai)/A0 ]×100%
A0—2.0mL DPPH·溶液定容為5mL的吸光度。
Ai—2.0 mL DPPH·溶液加入樣品溶液，定容為5mL的吸光度。
厚樸酚比和厚樸酚的活性弱，還沒達到IC50時，曲線就趨于平緩。在含量為4×0.000001mol時，和厚樸酚的抑制率為49.82%，而厚樸酚的抑制率僅為10.57%。作為對照物的蘆丁在該含量下，抑制率為92.0%。與之相比，厚樸酚與和厚樸酚的活性都較弱。
4 討論
從測定的結果來看，不同藥品的厚樸酚與和厚樸酚含量差別較大，可能與藥材來源、制劑和生產工藝的差異有關。此外用光度法測定二者的含量，預處理工作很重要，反復提取純化可以避免多種物質干擾。本文建立的利用二者pKa差異，通過調節測定pH值，使二者的紫外光譜出現不同，利用同一波長下，吸光度的加和性，從而同時測定厚樸酚及和厚樸酚的紫外分光光度法，與其它文獻方法相比，具有操作快速、簡便、準確及成本低等優點，為一些含有厚樸酚及和厚樸酚的藥品生產和質量監控提供了一種切實可行的分析方法。
此外，我們的研究表明，厚樸酚與和厚樸酚具有清除DPPH·活性，這是前人沒有報道過的。它們的測定結果從另外一方面證實了它們具有抗氧化活性。
參考文獻
1 國家醫藥管理局中草藥情報中心站.植物藥有效成分手冊第一版.北京：人民衛生出版社，1996.527—528，693—694
2 陸冬蓮，張尊聽，劉謙光，等.太白山區23種中草藥抗氧化活性的研究.天然產物研究與開發，2001，13(4)：20—22
3 王桂芳，張守堯，雷正杰，等.毛細管區帶電泳法測定厚樸藥材及其超臨界流體萃取物中厚樸酚、和厚樸酚的含量.中國藥學雜志，2001，36(4)：265—267