果膠酶的固定化及其活力測定
一、實驗目的:
果膠酶(EC.3.2.1.15)廣泛存在于植物界,參與果實的成熟及其它代謝過程。在果品加工業中,果膠酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。果膠酶的固定化將有助于提高酶的利用率,同時還可減少外源物質對果制品的污染。果膠酶需求量大,且多為一次性使用,既造成了很大的浪費,又大大提高了產品生產成本。固定化果膠酶可以重復多次使用,能夠減少果膠酶的使用量,節約生產成本。
二、實驗原理:
本實驗固定化方法為共價結合法。以殼聚糖為載體,通過戊二醛共價交聯固定化果膠酶。殼聚糖是從蟹、蝦外殼中提取的一種氨基多糖(α-氨基-1.4-β-葡萄糖多聚物),對人和動物無毒副作用,是一種具有網狀結構,機械性能好,化學性質穩定,耐熱性好的酶固定化載體材料,特別是殼聚糖分子中含有游離的氨基,通過化學交聯劑(如戊二醛)很容易與酶發生間接共價結合,使酶牢固地固定在殼聚糖分子上。果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸,可用DNS法定量:3,5-二硝基水楊酸與醛糖共熱能產生棕紅色的氨基化合物,在一定范圍內還原糖的量和含有呈色氨基化合物的反應液顏色深淺成正比,在540nm下測其吸光度,從而可計算出果膠酶活力。
三、試劑及儀器
儀器:冷凍離心機 分光光光度計 比色皿(8只) 搖床 水浴箱 混合振蕩器 天平 瓷盤 藥匙 剪刀(1把) 記號筆(1支) 通風櫥 吸水紙 具塞刻度試管(4支) 三角瓶(2支) 燒杯(50ml×3個) 試管架(1個)試管(6支) 量筒(50ml×1個)滴管(16個) 離心管(5ml×2個,50ml×1個)移液管架(1個) 移液管(2ml×3個,5ml×1個) 注射器(1支) 滴管(1個)吸耳球(1個) 洗瓶(1個) 玻棒(1個)燒杯(300 ml×5個)
試劑:乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.2mol/L,pH5.0) 磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH7.0) 3,5-二硝基水楊酸 氫氧化鈉 冰醋酸 丙三醇 戊二醛 95%乙醇 濃鹽酸 果膠酶 果膠 半乳糖醛酸 殼聚糖 蒸餾水若干桶
四、方法步驟
1 載體的制備
1.1取殼聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中,加20ml甘油攪拌溶解,制得殼聚糖溶液。
1.2配制40ml 10%的NaOH溶液,均分到三個小燒杯中。用注射器吸取約3ml殼聚糖的溶液滴入10%的NaOH溶液中,即得到殼聚糖的微珠。靜置10min,蒸餾水浸洗至中性,最后用pH7.0的磷酸緩沖液浸洗一次(3min)。
1.3傾去磷酸緩沖液。
2 載體的活化
三份載體中各加入4%的戊二醛溶液約20ml,過夜或室溫活化5h,中間搖動。
3 偶聯
3.1取果膠酶0.1g,加入18ml水、2ml乙酸-乙酸鈉緩沖液,搖床上振蕩5h,8000rpm離心10min,上清液即初始酶液,留2ml酶液置于一支干凈的5ml離心管中4℃備用
3.2水洗除去游離戊二醛(5min×5次)。
3.3將活化的載體合并,用所剩酶液覆蓋載體,4℃過夜。
4 活性的檢測
4.1水洗除去游離酶(2min×4次),回收在小三角瓶中的濾液即殘余酶液置于4℃備用。收集小球,濾紙吸干,4℃備用。
4.2按下表所述步驟加樣,進行固定化酶的酶活測定(20粒固定化酶顆粒稱重):
操作步驟 | 對照管 | 反應管 |
1 | 0.4%果膠4ml 50℃水浴中預熱5min | 0.4%果膠4ml 50℃水浴中預熱5min |
2 | 3ml pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液 | 3ml pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液 |
3 | 50℃準確反應1h | 加入完整的固定化酶顆粒20粒 50℃準確反應1h |
4 | 立即置于沸水浴中,快速 加入完整的固定化酶顆粒20粒 | |
5 | 沸水浴中煮沸5min | 立即置于沸水浴中煮沸5min |
4.3游離酶的酶活測定
操作步驟 | 甲管 | 乙管 |
1 | 0.4%果膠4ml 50℃水浴中預熱5min | 0.4%果膠4ml 50℃水浴中預熱5min |
2 | 2ml pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液 | 2ml pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液 |
3 | 加入初始酶液1ml 50℃準確反應1h | 加入殘余酶液1ml 50℃準確反應1h |
4 | 立即置于沸水浴中煮沸5min | 立即置于沸水浴中煮沸5min |