熒光素酶互補（Luc）實驗
【導入】
基于熒光素酶（Luciferase）的發光原理，形成了雙熒光素酶報告基因檢測系統。該系統包括螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海參熒光素酶（Renilla luciferase）。兩者可與各自的底物發生氧化作用產生生物熒光，產生的熒光值即表示兩種酶的表達量多少。
圖片來源[1]
Firefly luciferase和Renilla luciferase被稱為報告基因，是因為在表達調控研究時，利用兩者表達產生的熒光比值可監控微觀層面上的分子間相互作用。
具體做法：將靶基因的的轉錄調控元件或5'啟動子區融合在Firefly luciferase基因的上游，把3‘-UTR區或IncRNA序列融合在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動子的強弱和轉錄因子對啟動子的作用，或miRNA對目的基因/IncRNA的調控作用。
該系統中引入Renilla luciferase基因的TK載體作為內參，以消除細胞轉染等因素帶來的組間誤差。
其中luciferase來源于細菌、螢火蟲和發光海洋生物等，可以在哺乳動物細胞和植物細胞中直接表達，無需表達后修飾，直接具備完全酶活性。
與GFP不同之處在于luciferase的發光檢測不需要激發光激發，且發光穿透力更強，這使得Luc實驗具備可定量、高靈敏度及背景低等特點。
【利用熒光素酶互補實驗驗證植物蛋白互作】
基本原理
在驗證植物蛋白互作時，熒光素酶互補實驗 (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高靈敏度、可定量化、操作簡單高效被廣泛應用于植物學和動物學蛋白質互作研究[2]。
圖片來源[2]
目前, 應用最為廣泛的熒火素酶基因來源于北美螢火蟲 (firefly luciferase), 該基因編碼550個氨基酸組成的熒火素酶蛋白 (大小為62 kDa)。
實驗中, 熒光素酶蛋白被切成?N端?和?C端?2個功能片段, 即?NLuc (2–416AA)?和?CLuc (398–550AA)?。
在一個實驗體系中, 待檢測的2個目標蛋白分別與NLuc和CLuc融合, 如果2個目標蛋白相互作用, 則熒火素酶的NLuc和CLuc在空間上會足夠靠近并正確組裝, 從而發揮熒火素酶活性, 即分解底物產生熒光 。
實驗過程
將含有融合蛋白的植物表達載體轉化農桿菌 (Agrobacterium) 后注射煙草葉片。24–48小時后，加入反應底物熒火素, 利用植物活體分子影像系統 (CCD imaging system) 或luminometer來定性定量檢測熒光強度, 以判定目標蛋白之間是否存在相互作用及互作的程度。
載體圖譜
