第一部分RNA 提取策略

1、RNA降解的原因內源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因為人體細胞自身就是幾十分鐘（20min？）mRNA被降解一輪，所以不管是組織還是細胞還是液體狀樣本在離開其中細胞的最佳生活狀態后都應該盡快的被妥善的方法保存起來。外源性RNA酶也是一個需要注意的因素，最常見的就是毛發尤其頭發，灰塵，唾液，塑料手套這四個兄弟。針對它們我們應該戴帽子，口罩，橡膠無菌手套，在清潔灰塵少的地方提取RNA。我上面說了內源性RNAase污染才是關鍵，所以有些同志沒有注意這些對外源性RNAase的防護RNA也提取的很出色。但是如果你運氣不太好的話外源性RNAase污染影響很大的。

2、樣品的取材 我們抽提RNA往往都是需要其mRNA，而mRNA的表達量和細胞或者組織的生長狀態息息相關，我們取組織塊應該避免取到壞死組織，而細胞我們應該在其處于生長旺盛的時期收集（貼壁細胞消化要迅速，離心要稍為快些，甚至可以不消化下來直接進入裂解步驟；此外還可以采取先震蕩敲擊培養瓶的方法使細胞和培養瓶的結合下降，然后用吸管吹打培養基地方法把細胞吹打下來，這樣細胞的代謝不會明顯的受到抑制。注意在平時傳代的時候就要注意觀察細胞除了用胰酶消化下來以外是否還有其他比較簡單的方法）（此外還可以把培養液倒掉后迅速的加入裂解試劑開始抽提ＲＮＡ）。

3、待提取樣品保存方法這些保存方法溫度從4度到零下196度不等，選擇哪一種保存方法關鍵是要對這些保存方法的優缺點有清醒的認識。根據你需要的RNA種類可以做簡單的分類。包括RNA病毒RNA ，mRNA（各種），rRNA等其中最容易降解或者破壞的就是mRNA，最不容易損失的就是RNA病毒RNA（因為有蛋白殼保護）。超低溫保存： 特指液氮保存不管組織還是細胞如果需要其中的mRNA必須在液氮中保存，-70度等方法都是錯誤的方法，在很短的時間內或許可以，但是長期是不可能的。-20~~~-70攝氏度保存： RNA病毒的RNA可以在這個溫度段安全的保存。但是其產生的mRNA還是必須超低溫保存。

4度保存： 有特殊的保護試劑存在地情況下組織的保存：應該是離體后在1min內就放入液氮或者保護試劑中。由于提取RNA對組織塊有一定量的要求，大約100mg居多（脂肪細胞需要的量多的多，因為細胞是大大膨脹的），所以在取材前就需要明確到底你需要的組織大概多大是100mg，令少勿多。如果是取臨床的標本，就應該帶上液氮罐子，DEPC處理的器械，錫箔紙，線等在手術室外等候，標本一切下就盡快進行切割（大概100mg一塊），包裝（錫箔紙內），捆扎（方便在液氮罐子中尋找），迅速丟入液氮罐子中，最好是1min內完成（所以大家取材前一定要好好聯系一下，不要到時候手忙腳亂的^_^）細胞的保存：比較麻煩些，所以大多都是直接提取RNA再保存。建議離心收集后用特殊保護試劑重懸后保存。

4、RNA提取提取RNA可以分為總RNA，mRNA，Virus RNA（RNA病毒）幾類Trizol即異硫氰酸胍-苯酚法，這種方法的原理是：首先用強變性劑異硫氰酸胍裂解細胞，同時使核蛋白復合體中的蛋白變性，釋放出核酸。釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH時溶解度不同，分別位于整個體系中的中間相和水相，從而使DNA和RNA分離開來。進一步通過有機溶劑來抽提沉淀RNA，就可以得到純凈的RNA；

Trizol最早是MRC實驗室的科學家發明的方法，后來把專利賣給了invitrogen/Gibco，invitrogen/Gibco將此方法推廣到世界。他的trizol曾經由其他公司OEM制作，現在已經自己生產。本來Trizol是一個專利的品牌，但是國內也有不少仿制的品牌，基本的原理是一樣，配方稍有不同。RNeasy kit： Qiagen的王牌產品，號稱適用于各種RNA抽提，其實在特殊的組織比如大腦，肌肉，脂肪組織還是選擇特殊抽提試劑為佳。此外細菌RNA抽提也最好使用專用抽提試劑盒。這些產品Qiagen都提供。注意凡是Qiagen的試劑盒抽提應該是沒有5S帶的，因為它將5S破壞掉了。其他的比如roche，promega等都很好的是的。尤其promega性價比最高！

注意各種方法對于組織都需要先碾磨，應該用陶瓷碾磨器，同時一定要在碾磨同時不斷的加入液氮。（少數牛人號稱從來不加液氮也提取的很好，我只能說他運氣實在不錯）。

特殊的RNA抽提試劑盒---mRNA抽提試劑盒： 單純的抽提mRNA的試劑盒很少見到有人在使用，但是其具有一般RNA抽提試劑盒沒有的優點，在一些實驗中有出奇致勝的效果，推薦promega的總RNA提取KIT，效果與Qiagen差不多，價格便宜多了，性價比最高的好東東！ (責任編輯：大漢昆侖王)