畢赤酵母高效轉化實驗方案

畢赤酵母高效轉化實驗方案 1.收集菌體 取1mlGS115過夜培養物(OD約6-10) 分裝到1.5ml EP管中，4℃、10000g 離心1min，棄上清，沉淀用無菌水(4℃)洗滌，同樣條件下離心，棄上清。 2.菌體處理 加入1ml處理液，室溫下放置20min。 處理液： 10mM LiAc 10mM DTT 0.6M sorbitol 10mM TrisHCl(pH7.5) 3.離心，棄上清，加入1ml 1M sorbitol ，離心，棄上清， 4.用1M sorbitol洗滌二次，到最終體積約為80μl.（菌體太多可適當棄去部分） 5.加入10μl.經過BglⅡ酶切處理的工程質粒，混勻后轉入 電擊杯中，冰浴5min. 6.電轉. 1.5kv，25μF，200Ω條件下進行電轉。 7.電擊后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培養2h。 8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分別為100、200微升，剩余的經離心處理后全部涂在一個平板上) 有一點要注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨于-20度保存，可配成100倍的貯備液。