DNA序列和大規模DNA測序策略的探討

人類基因組計劃的核心內容之一是基因組測序。隨著人類基因組圖譜趨于完成，人類基因的定位克隆、鑒定分析直至全基因組測序取得了突破性進展，測序策略的成熟、測序方 法的改進、自動測序儀的廣泛應用、計算機數據分析系統的擴展以及測序分析能力的提高， 大大推進了大規模DNA測序的進程。

第一節 DNA測序的基本方法

一、Maxam-Gilbert的化學降解測序法

①先用限制性內切酶把DNA切成10―200bp 的測序材料，②用堿性磷酸化酶處理該片段，消除5′末端上的磷酸，③在5′OH端標記32 P，用多核苷酸磷酸激酶催化，④標記片段變性為單鏈，⑤化學試劑在特定堿基位置降解單鏈DNA， 產生一組長度不等的DNA片段，⑥經電泳和放射性自顯影后，從4個反應系統統一閱讀， 待測DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出。

二、Sanger的酶降解測序法(鏈終止法)

這項技術的關鍵是在DNA的聚合過程中依賴特殊反應底物(2′3′―雙脫氧核苷三 磷酸ddNTP)的特異性終止進行DNA測序。

第二節 DNA測序的策略

一、定向測序策略

定向測序策略是從一個大片段DNA的一端開始按順序進行分析 。傳統的方法是用高分辨 率限制酶切圖譜確定小片段的排列順序，然后將小片段亞克隆進合適的克隆載體并進行序列 分析。

二、隨機測序戰略

隨機測序戰略又稱鳥槍戰略(shotgun strategy)，此策略是將人類基因組DNA用機械方法隨機切割成2Kb左右的小片段，把這些DNA片段裝入適當載體，建 立亞克隆文庫，從中隨機挑 取克隆片段。最后通過克隆片段的重疊組裝確定大片段DNA序列。

三、多路測序戰略

多路測序戰略(Multiplex method)是鳥槍法的一種發展策略，是通過多個隨機 克隆同時進行電泳及閱讀，快速分析DNA序列的一種技術。這種方法的復合隨機克隆文庫來源于相同的基因組DNA。將 DNA片段克隆到20種不同的質粒載體上，再亞克隆進不同的質粒載體。將來源20個亞克隆庫的克

四、聚合酶鏈式反應(PCR)

反應程序包括三個步驟：(1)DNA雙鏈加熱(94℃)變性成單鏈 ；(2)加入兩種DNA單鏈引物，分別與兩條模板鏈退火(55℃)；(3)DNA聚合酶從兩引物的3′ 端按模板要求合成新生DNA鏈(72℃)。重復操作，可使DNA快速擴增，20個循環后可使模板DN A 擴增1萬倍，30個循環后可使模板DNA含量放大100萬倍，只需2個多小時的時間。