核酸定量分析 DNA 或 RNA(以260nm處的吸光值為基礎) 1. 制備用蒸餾水稀釋過的DNA 或 RNA 樣品溶液 ( 典型稀釋比為 1:100 或 5:500μl) 2. 使用紫外光源,在260 nm 處測定吸光值,也可以在280 nm 和230 nm 測定吸光值 (260/280 的光吸收值比粗略為2/1；260/230的光吸收值比也應接近 2/1) 3. 計算原液濃度: A260 x 轉化系數 x 稀釋率 = DNA 原始濃度 (μg/ml)光吸收值單位 雙鏈 DNA 的轉化系數是 50μg/ml；單鏈 DNA 和 RNA 的轉化系數是 40μg/ml 平均的脫氧核苷酸(堿基) 分子量是 326.95，因此，平均的堿基對的分子量是753.9。 為便于計算，這個值的單位可以用微摩爾，比如下面的例子: (2 x μg DNA)+[753.9 x(雙鏈DNA的堿基對數)] 因此，1 μg的 pUC DNA就等于 2 x 1 μg + [753.9 μg/ μmol bp x 2676 bp] 或 2 μg + 2017436.4 μg/ μmol = 1 x 10-6 μ摩爾 寡核苷酸 1. 寡核苷酸的消光系數(∈)的計算: a. 將堿基A、C、G 和 T 的出現次數用表格統計出來 b. 乘以如下數值: A的次數 x 15.4 ml/µmole C的次數 x 7.3 ml/µmole G的次數 x 11.7 ml/µmole T的次數 x 8.8 ml/µmole c. 這些結果的總和就是消光系數，∈ 2. 測定寡核苷酸溶液在260nm 的吸光值 3. 用下列公式計算濃度: 濃度 = A260 ÷ ∈ (注: μmol/ml = mM) NB. 購買的寡核苷酸通常是冰凍干粉的形式，以O.D. 值為計量單位。一個O.D.單位相當于這一個樣品在 1 毫升中(初略)重懸浮后的A260值。用上述公式，此數據即可用來估測寡聚核苷酸在這種溶液中的濃度，以這個數據為基礎，可以準備更合適的寡聚物的濃度。 例如： 一個寡核苷酸的∈為262.9 ml/µmole，現在有一 3 O.D.的寡核苷酸；因此，1 ml的溶液的濃度可達 262.9 ml/µmole = 11.4μM，那么要獲得一 20μM 的溶液，由于 C1V1 = C2V2: 1ml x 11.4 µM = ? x 20 µM；(1ml x 11.4µM)/20µM = 0.570ml. 需將此液在 570 µl 中重懸浮! © P. Lessard 2002, 保留所有權利。