骨髓基質干細胞修復顱骨缺損

骨髓基質干細胞修復顱骨缺損

1.實驗動物

畢格犬平均1歲齡，雌雄不限。氯胺酮10mg/kg肌內注射誘導后，肌內注射速眠新o.1m1/kg全麻，常規消毒、鋪巾。16號骨髓穿刺針于髂前上棘或股骨近端穿刺，抽取骨髓3-5ml，置于50m1離心管中(所用器械均事先肝素化)。2.BMSC培養及成骨誘導

3.細胞-生物材料復合物制備

pDBM(脫鈣骨基質，上海市組織工程研究與開發中心研制)預先制備成2.5cm×2cm×0.3cm片狀，細胞培養同前一部分。每塊材料接種4×106經成骨誘導的BMSC，體外繼續培養l～4天后，準備回植入動物體內。

4.動物實驗試驗分組

(1)實驗組：顱骨缺損區植入pDBM/BMSC復合物。

(2)材料對照組：顱骨缺損區植入單純pDBM。

(3)空白對照組：雙側顱骨區造成缺損后曠置。

5.手術回植

狗麻醉前禁食12 h，禁水4 h。氯胺酮10 mg/kg肌內注射，進行誘導麻醉，速眠新0.1m1/kg肌內注射麻醉，整個過程中動物保持俯臥位。

動物麻醉平穩后，常規消毒鋪巾，頭部正中矢狀切口，暴露雙側顱骨區，使用顱骨轉，雙側各形成2.5cm×2cm全層顱骨缺損，同時去除缺損區骨膜，徹底止血。一側缺損區為實驗組，植入pDBM/BMSC另一側為對照組植入無細胞單純pDBM。

6.術后新生骨的評價

(1)三維CT檢查：術后3、6個月顱骨三維CT檢查。

(2)大體觀察：術后3、6個月取材時，暴露雙側顱骨區觀察愈合情況。

(3)組織學：術后3、6個月取材，實驗側和對照側標本中部和邊緣分別取材，石蠟包埋，組織學切片，進行HE和Azan三色染色。

(4)硬組織切片和四環素標記新生骨：術后3、6個月取材，實驗側和對照側標本中部和邊緣分別取材，取材前2周靜脈滴注四環素(10mg/kg)。