同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。NEB每一種酶都隨酶提供相應的最佳NEBuffer，以保證100%的酶活性。NEBuffer的組成及內切酶在不同緩沖液中的活性見《內切酶在不同緩沖液里的活性表》及每支酶的說明書。

能在最大程度上保證兩種酶活性的緩沖液即可用于雙酶切。由于內切酶在非最佳緩沖液條件下的切割速率會減緩，因此使用時可根據每種酶在非最優緩沖液中的具體活性相應調整酶量和反應時間。

如果找不到一種可以同時適合兩種酶的緩沖液，就只能采用分步酶切。分步酶切應從反應要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切反應。

使用配有特殊緩沖液的酶進行雙酶切也不復雜。在大多數情況下，采用標準緩沖液的酶也能在這些特殊緩沖液中進行酶切。

這保證了對緩沖液有特殊要求的酶也能良好工作。由于內切酶在非最佳緩沖液中進行酶切反應時，反應速度會減緩，因此需要增加酶量或延長反應時間。通過《內切酶在不同緩沖液里的活性表》可查看第二種酶在特殊緩沖液相應鹽濃度下的作用活性。

雙酶切建議緩沖液

注：

只要其中一種酶需要添加BSA，則應在雙酶切反應體系中加入BSA。BSA不會影響任何內切酶的活性。

注意將甘油的終濃度控制在10%以下，以避免出現星號活性，詳見《星號活性》。可通過增加反應體系的總體積的方法實現這一要求。

某些內切酶的組合不能采用同步雙酶切法，只能采用分步法進行雙酶切。上表中這些組合以"seq"標注。