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PCR技術應用七：地中海貧血
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地中海貧血是由組成珠蛋白的X珠蛋白鏈和B珠蛋白鏈基因突變的引起，它包括X 地中海貧血和B地中海貧血，世界疾病在我國南方各省區的發病率相當高，個別地區 可達18%，它的嚴重的影響人口的質量.
一、地中海貧血的臨床
(一)X地中海貧血的臨床:X地中海貧血在臨床上可分為四 種類型①HbBarst胎兒水腫綜合征②HbH病③輕型(標記型)X地中貧血及④靜止型地中 海貧血.(二)B地貧在臨床上亦分為四型①重型B地中海貧血，②輕型B地中海貧血③中 間型地中海貧血及④遺傳性胎兒Hb持續存在癥.其中第④類型較為常見.
二、地中海貧血的遺傳學
(一)α地中海貧血:α地中海貧血的發生是由于α珠蛋 白鏈基因突變的結果，α珠蛋白是基因定位于16P16-4er)，每條染色體上均有兩個α 珠蛋白基因，該基因其長30Kb其中包括有兩個假基因和一個胚胎性Hb鏈基因，每個α 基因含有兩個內含子和3個外顯子總長約0.5Kb.(二)β地中海貧血:β地中海貧血由β 珠蛋白鏈基因突變所引起，該基因定位于11P15.5，總長度約70Kb，其中有許多胚胎性基因及假基因，而β珠蛋白基因有兩個內含子和3個外顯子，總長約為1.126Kb.
三、α和β珠蛋白基因的突變類型
(一)α-基因的突變:在α-基因的突變中，以 缺失型突變最為常見，其缺失的范圍可從兩個α-基因均缺失至一些小片段的缺失均 可在人群中檢出，α-基因的另一突變即為單堿基置換，目前已發現的突變有18種以 上，它包括錯義突變，無意突變剪接部位突變及起始信號突變.(二)β-基因的突變: β-基因的突變以點突變為主，即單核苷酸置換是β-基因的主要突變類型，它亦有堿基的括入和缺失，在我國檢出的β-基因點突變見下表:
| 位置 | 性質 | 對基因功能影響 | 類型 |
| 啟動子區(TATA) | |||
| -32 | C →A | ||
| -30 | T →C | mRNA 轉錄效率下降 | |
| -29 | A →G | β鏈合成減少 | β＋ |
| -28 | A →G | ||
| RNA 剪接基因突變 | |||
| IVS-1n ＋1 | G →T | ||
| IVS-1n ＋5 | G →C | mRNA 合成異常 | β＋ |
| IVS-13 | T →G | ||
| IVS-2n ＋654 | C →T | ||
| 誤義突變 | |||
| CD26 | G →A | 正 | |
| 無意突變 | |||
| CDn | A →T | β鏈合成短 | β |
| CD43 | G →T | ||
| 突變 | |||
| 缺失: | CD8―AA | ||
| CD31―C | |||
| CD41/42-TCTT | |||
| 括入 | ＋40 ±43-AAAC | ||
| CD14/15 ＋G | |||
| CD27/28 ＋C | |||
| CD71/72 ＋T ，＋A | |||
| 起始裂解 | |||
| ATG →AGG |
四、PCR技術在α地貧基因診斷中的應用
α地貧是由α珠蛋白基因不同范圍的缺 失及點突變所致，但以缺失型突變最為常見，因此，α地貧PCR診斷的主要任務就在于快速檢出α珠蛋白基因的缺失片段.
(一)α基因全部缺失(--1--)的PCR診斷
α基因全部缺失所引起的臨床表現為HbBar+胎兒水腫綜合征，用PCR方法檢測等，其反應體系組成如下:
引物:
PC01；5'TACTGTAGATACCCGTGTACAA3'
PC02；5'ATCARGGAAACATAGTAAT3'
PC03；5'ACACAACTGTGTTACCTAGC3'
PC04；5'CAACTTCATCCACGTTCACC3'
擴增片段：αPC01-PC02；136；-
βPC03-PC04；110；110
擴增條件：93℃(30'')；45℃(30'')；65℃
檢測： 3%珠脂糖電泳
注 ):PCO3和PCO4擴增片段位于β基因，作為內對照.
結果判定:在正常人PCO1-PCO2擴增片段為B6bp，PCO3-PCO4為110bp，而HbBart胎兒水腫綜合征僅有PC)3-PCO4的110擴增片段而無PCO1和PCO2的136bp擴增產物.
(二)部分α基因缺失型的PCR檢測
除HbBart胎兒水腫外，在α地貧中，尚有部分α基因缺失的類型，它仍是α地貧2，α地貧HbH病，應用PCO1和PCO2時正常和缺失染色體均有擴增，因此對2，2，HbH及正常個體不能鑒別，因此又有人設計了一組新的引物體系進行α基因缺失的檢測，該本系的組成及操作過程如下
| 引物名稱 | 序列位置 | ? |
| S1 | F5'GTGTTCTCAGTAT TGGAGGGAA3' | 4 S1 3' 端 |
| S2 | F5'GACACGCTTCCA ATACGCTTA3' | α3'HVR 5' 端 |
| S3 | R5'CTACTGCAGCCT TGAACTCC3' | 4 α2 5' 端 |
| α1 | F5'CGGGCCTGGGCC CTCGGCCC3' | ? |
| ? | R5'CCACGGGGGTAC GGGTGCAG3' | 二者的3' 端 |
| α2 | F5'CGGCTGCGGGCC TGGGCCGC3' | ? |
| ? | R5'ATTCCGGGACA GAGAGAACC3' | ? |
五、PCR技術在β地貧基因診斷中的應用
β地貧的基因突變主要是單堿置換.目前在世界范圍內發現的單堿基置換達160余種，其中在中國發現的有21種，由于β珠蛋白基因的突變主要為單堿基堿置換，因此其診斷途徑與β地貧完全不同，其診斷的主要目的即檢出點突變.
(一)檢測已知突變位點
1.PCR-ASD與ROB
PCR-ASO是快速簡便的檢測已知β珠蛋白基因點突變的方法，主是利用PCR技術擴增靶基因的適當片段，然后用人工合成的含突變位點的標記寡核苷酸探針，逐一篩查，泛檢測的反應體系包括.
引物 :見下表
| 引物名稱 | 位置 | 序列 | 擴增片段大 小bp |
| βA | -129--104 | A5'GTACGGCTGTCATC ACTTAGACCTCA3' | A →B600 |
| βB | 編碼97-89 | B5'TGCAGCTTGTCACA GTGCAGCTCACT3' | C →D422 |
| βC | EVS-2475-476 | C5'GTGTACACATATTG ACCAAA3' | A →D1502 |
| βD | 編碼114 →108 | D5'AGCACACAGACCA GCACGTT3' | 41 |
點膜與雜交:PCR-ASO 是將PCR 擴增產物點于雜交膜上，然后與上述的ASO 探針雜交，根據雜交的結果判斷分析，以確定突變位點RDB 以改傳統的雜交途徑，它是將一系列的標記ASO 探針固定在膜上，然后用之與PCR 擴增產物進行雜交，使檢測程序大大簡化.
張是增等人根據我國常見的β基因突變情況，將18 種5 突變分為兩組，一組為常見的，另一組為非常見，與這些突變相對應的ASO 探針反分為兩組，將這些探針固定于膜上，再與相反的PCR 擴增產物進行雜交，常用的7 種ASO 探針可檢出98% 的中國人β基因點突變同RDB 方法簡便，快速，使用非同項素標記的ASO 探針使之節約于推廣，而是探針膜條便于保存和運選.
2. 等位特異 PCR(ASAPCR)
ASAPCR 是檢測已知β基因突變優點進行β地貧基因診斷又一有效手段，有人用該方法檢測Cordows41-42 ，TVSnt654 ，CD17TATA 盒-28 和CD71-72 ，這五種我國南方常見的β基因點突變診斷β地貧，完成的用于產前診斷.
3.PCR-RFLP 檢測 引起內切酶切點改變的突變診斷β地貧.
| 突變位置 | 內切酶 | 切點影響 |
| β | Mnl Ⅰ | 丟失 |
| CD17 | Mae Ⅰ | 生成 |
| -29 | NIa Ⅲ | 生成 |
| CD43 | Hinf Ⅰ | 消失 |
| TVS-1nt1 | BsPM Ⅰ | 消失 |
| CD41-42 | HinFZ | 酶解產物變化 |
(二)突變性質不明β地貧的診斷
在β地貧中，尚有一部分人群的基因突變性質不明，但臨床表現為β地貧則可用PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGG進行突變片段篩查，然后對異常的片段進行快速測定，以確定突變位置性質及β地貧的關系.
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