受體菌感受態細胞的制備

一、目的與原理

當細菌處于容易吸收外源DNA的狀態時，即為感受態，而用理化手段使細菌處于感受態的操作為致敏過程。感受態細胞制備是重組基因能否實現轉化的一個重要的技術環節。本試驗是通過鈣離子來誘導使之成為感受態細胞。

二、材料和方法

1． 材料：大腸桿菌

2． 儀器：

離心機，恒溫搖床，恒溫水浴，超凈工作臺，冰柜

3． 試劑

LB培養基，0.1M MgCl2，3mM氯化六氮合高鈷

TFB：10Mm MES（pH6.3）

45Mm MnCl2

10Mm CaCl2

10Mm KCl

三、操作步驟

大腸桿菌在LB培養基平板上劃線培養12-16小時，挑取單菌落于LB培養基搖瓶培養大腸桿菌到對數期。取1ml培養物7000rpm，離心3min，收集菌體。再重復一次。冰浴放置。用預冷的氯化鎂懸浮菌體7000rpm離心3min。收集菌體，冰浴放置。

用預冷的氯化鈣懸浮菌體，冰浴15min, 7000rpm離心3min。收集菌體，冰浴放置。加入200μl預冷的氯化鈣（或TFB），放置于冰浴，即得感受態細胞，此細胞可現用，也可進行下步操作。將懸液分裝于無菌離心管中，投入液氮，然后儲于-70℃保存。

四、結果 （略）

五、注意事項

一般地，新制備的感受態細胞48h后轉化效率降低，15d后失效。因此，感受態細胞不能保存太久，4℃保存一周，但-80℃可保存1年。用試管分裝可避免反復凍熔，損傷感受態細胞。