摘要：

SOD的催化使超氧自由基(O2-)被破壞，并針對氧毒性筑起了第一道防線。SOD的活性及其檢測技術與許多不同領域都息息相關，如醫藥、生化、植物生理、食品工程等。在過去的幾十年中，人們已經發現了各種各樣的SOD檢測方法，但是，這些方法在選擇性、檢測速度、價格、簡便程度上都存在各自的缺陷。

最近，我們發現水溶性四唑鹽如XTT，WST-1，WST-8適合用于O2-的檢測并且也可以被用于SOD的檢測。在這些四唑鹽中，WST-1靈敏度高，氧化態的吸光度低，水溶性好，因此，最適合用來做SOD檢測。

這種用WST-1來檢測SOD的方法可以被用于鼠紅血球、心臟、肝臟等生化樣品中。我們還發現了一種使用了WST-1的流式注射法檢測SOD的檢測系統，通過這個系統能夠進行快速的檢測（每小時可以檢測30個樣品）。

常用的幾種SOD檢測方法：

1． 分光光度

分光光度法是最為典型的檢測SOD的方法，這種方法使用了細胞色素 C(cytochrome C)或者氮藍四唑（NBT）。用cytochrome C的還原法來檢測O2-是因為還原后的cytochrome C會生成紫色的染料。這是自SOD被發現以來最常用的方法。

Cyt(FeⅢ) + O2- ―> Cyt(FeⅡ) + O2

因為cytochrome C很容易被NADPH還原酶或者其他的還原劑所還原，因此必須要考慮樣品的污染因素。而且，這種方法需要每隔1.5分鐘就要察看一下，因此不適合做大批量的實驗。NBT法的原理是生成不溶于水的藍色甲染料(lmax: 560 nm)去和O2-反應。

這種染料不溶于水，在做長時程分析時會生成不均一的沉淀物，從而影響實驗數據的重現性。為了得到水溶性的甲染料，許多改良后的方法如添加BSA被人們所采用。但是，添加了不必要的蛋白質會使數據分析變得十分復雜，而且NBT會被多種還原劑所還原。

NBT的這種特性被用于酮胺的檢測，酮胺可以作為糖尿病的標記物并且是Maillard反應的中間體。NBT法的最大缺點是即使加入過量的SOD也不能獲得100%的抑制率，原因是NBT會與黃嘌呤氧化酶直接反應。

2． 化學發光法

用于O2-檢測的化學發光探針同樣也能用于SOD的檢測，這種探針分為2種，一種是光澤精，另一種是熒光素衍生物（MCLA）。這種化學發光反應對pH有高度的依賴性。例如，光澤精只有在pH 9.0或者更高處會發出強烈的化學光。

因此，在生理的pH條件下用這種方法檢測SOD是不可行的。另一方面，MCLA在生理條件下能夠發出較強的化學熒光，因此可以用于人腦的Cu,Zn-SOD活性的檢測。

但是，MCLA不適合用作SOD檢測的探針，因為它不單單和O2-反應，還會和單質氧反應。而且MCLA與溶解氧反應后會發出化學光，轉移的金屬離子還會加速氧化反應。

3.電子自旋共振（ESR）光譜法

在室溫下，溶液中O2-的ESR信號不能直接被檢測出，但能夠通過自旋捕捉法間接獲得。最常見的誘捕劑是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)。由于O2- 誘捕DMPO會產生一個特殊的光譜圖，因此ESR法是O2-檢測的方法中特異性最好的一種。

然而，DMPO與O2-間的二階速度常數比O2-自發反應常數相對要低，因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：終濃度為0.45M）。這樣，每次試驗所要用的DMPO將花去大筆的經費。

這種方法的另一個問題是在實驗中需要一套較為昂貴的ESR設備。

4．利用水溶性四唑鹽檢測SOD的新方法

為了克服上述的諸多問題，我們在做SOD檢測時需要考慮如下幾個方面：實驗設備要簡單、經濟，pH靈敏度要低，對O2-有高度的特異性。如果用分光光度計作為一種簡單的實驗設備的話，就需要一種與cytochrome C和NBT相似的比色探針。

檢測中最重要的一點是在沒有其他物質干擾的情況下，測定出SOD100%的抑制率。為了得到一種新的檢測SOD的方法，我們對還原后能生成水溶性甲的四唑鹽作了一系列的實驗。

4.1 XTT

XTT是一種在1988年首次被報道的水溶性四唑鹽，自從那時起，它就被用作細菌或者哺乳動物細胞電子轉移系統的底物。它的結構如圖1所示。NBT具有一個雙四唑鹽結構，而XTT的結構則為單四唑鹽并且有兩個璜酸基團。

我們用XTT來檢測SOD，如圖2所示，隨著SOD濃度的上升，可以觀察到100%的抑制率。這種100%的抑制率在過去用NBT法時從沒得到過。即使在不同的pH條件下，仍能觀察到100%的抑制率。XTT的這種100%的抑制率意味著XTT只會被O2-特異地還原，XTT解決了NBT所不能解決的問題。

反應混合液包含2.5 ml 50 mM的碳酸鹽緩沖液（B,pH 9.4;C,10.2）或者50 mM的磷酸緩沖液（A,pH8.0）以及3 mM 的EDTA,3 mM的黃嘌呤，56.1 mU/ml的黃嘌呤氧化酶各0.1 ml，0.75 mM的XTT或者NBT以及如橫坐標所示濃度的SOD樣品溶液。

在NBT法中，還需添加0.1 ml的BSA。NBT除了會和黃嘌呤氧化酶反應外還會和葡糖氧化酶反應。我們向含有葡糖氧化酶的葡糖氧化反應液中加入XTT和NBT,然后測量生成的甲。

即便是在不生成O2-的葡糖-葡糖氧化酶反應中，NBT還是被還原并生成了甲，但是XTT這一方面卻沒有OD值的增加。最初隨著XTT濃度的增加OD值會有所上升，這是因為XTT四唑鹽背景OD值所引起的。從這個結果看來，XTT似乎不會和氧化反應過程中所生成的一些酶的還原態有直接的干擾，XTT是一種適合用于SOD檢測的探針。

試驗混合液（2.8 ml）含有下列成分：50 mM glycine-NaOH(pH 9.5),0.1 mM葡萄糖，0.1 mM NBT(●)，0.1 mM XTT(△)或者0.2 mM XTT(○)。反應從加入葡糖氧化酶后開始。檢測25℃下470nm處（XTT）和560nm處（NBT）的吸光度。為了測試XTT對實際樣品的可行性，我們用XTT法檢測了兔紅血球的SOD活性，并和NBT法所得的數據進行比較。

從紅血球中提取的SOD初提物按照常規的方法進行分離。XTT法與NBT法的相關系數為0.954。由XTT法所得的數值大約為NBT法所得數值的2倍，反應了這2種方法的敏感性的不同。接下來，我們用這種方法來檢測食品樣本中的SOSA。

眾所周知，食品樣本是由多種成份組成的復雜的混合物。紅酒、綠茶、咖啡、可可這些樣品可以被拿來用XTT檢測SOSA，因為這些樣品已被證實含有SOSA。如同預期的一樣，未經稀釋的食物樣品的顏色會形成干擾，樣品中的物質直接還原了XTT。

為了得到10%或者更少的吸光度的變化，茶、紅酒、速溶咖啡、可可等需要在pH8下分別稀釋100倍，10倍，50倍和10倍。每一種稀釋后的樣品溶液在每個稀釋度上都有超過50%的抑制活性，因此可以證明XTT在檢測食物樣品中的SOSA時是有用的。

這些結果與用ESR所得出的數據是相一致的。從這些結果中我們可以得知XTT不僅可以用于生物樣品的檢測還可以用于食物樣品的檢測。

XTT克服了NBT所不能克服的許多問題，因此XTT看似為更合適的SOD檢測法。但是，我們在用XTT法試驗中，又遇到了幾個新的問題。其中一個就是依賴于pH的靈敏度的變化。

由NBT法所得的數據在pH8～10.2之間都是較為穩定的，但是在用XTT法時，如果降低了pH值會引起試驗靈敏度的降低。因此，XTT法在pH8的靈敏度比NBT法要小。另一個問題是XTT的水溶性，XTT的水溶性在2 mM左右，并且需要一個加熱過程來制備最佳XTT溶液(0.75 mM)。

4.2 WST-1和WST-8

從1993年到1998年，Ishiyama博士和他的研究小組發現了好幾種水溶性的四唑鹽。由于這些四唑鹽的水溶性為數十mM到數百mM，因此我們可以用它們來代替XTT進行SOD檢測。在這個實驗中，我們采用了WST-1和WST-8（其結構式如圖1所示），WST-1和WST-8都是具有磺酸基的單四唑鹽。首先，我們用標準的SOD來優化反應條件。

反應混合液包括2.5 ml磷酸緩沖液(A,pH8.0)或者50 mM碳酸鹽緩沖液(B,pH 9.4;C,pH 10.2)以及0.1 ml 3 mM的EDTA，3 mM的黃嘌呤，58 mU/ml的黃嘌呤氧化酶，0.75 mM的WST，還有橫坐標上所示濃度的SOD樣品溶液。

WST-1和WST-8都顯示了XTT法中出現的100%的抑制率，需要注意的是，在不同的pH下是否能得到幾乎相同的IC50。這個結果顯示了WST法可以解決在XTT和NBT法中所存在的問題，是檢測SOD的理想的試劑。由于可以得到100%的抑制率，接下來我們就要用WST-1和WST-8來確定是否會像XTT試驗中那樣由葡糖-葡糖氧化酶反應生成甲。

試驗條件與圖3中所用的相同，試驗混合液含有0.1 mM NBT(■)，0.2 mM WST-1(●)或者0.2 mM WST-8(○)。需要在25℃下檢測438(WST-1)，460（WST-8）或者560nm(NBT)的吸光度。

如同預期的一樣，沒有因葡糖-葡糖氧化酶反應而生成甲。而且隨著WST濃度的增加，背景OD值并沒有增加。因此，WST能夠在背景較低的條件下檢測SOD的活性。為了比較WST的靈敏度，我們將WST法所得的IC50與用XTT法和NBT法所得的進行比較（表1）。

表1: pH 10.2下各種四唑鹽所得的IC50的比較 四唑鹽 IC50(ug/ml) WST-1 0.22 WST-8 0.75 XTT 0.26 NBT 0.55

IC50的值是在pH 10.2下測出的，這些數值顯示WST-1在這些四唑鹽中檢測SOD活性的靈敏度最高。由于WST-1的檢測靈敏度最高，所以我們用它來檢測鼠紅血球的SOD活性并同XTT法檢測出的數值進行比較。結果，WST-1和XTT法的結果線性相關，相關系數為0.968。（n=7）

最近，Winterbourn博士小組證實了WST-1在SOD活性檢測中的用途并發明了一種微孔板方法來檢測SOD的活性。這種微孔板法可以用來檢測人的紅血球，鼠肝和心臟組織勻漿，其檢測結果與過去用其他方法所得的結果是十分一致的。

如此看來，WST-1在生物樣品上的應用是十分廣泛的。最近，我們正在研究其在植物組織和食品樣本中的用途。

為了得到一個WST-1法的自動分析系統，我們使用了流式注射分析法（FIA）。

p, pump; IV, injection valve; D, detector

在該系統中，我們使用了黃嘌呤氧化酶固定受體來避免試驗中外源酶的影響，使該系統既快速又經濟。在一系列試驗之后，我們同時在受體上固定過氧化氫酶并以次黃嘌呤作為底物來增加黃嘌呤氧化酶的穩定性。

實驗前，我們預先制備了次黃嘌呤和WST-1的混合液，并將其與樣品溶液按1：9的體積比混合，然后將20 μl該混合液注入受體。如果樣品中不含SOD，那么WST-1的甲生成量達到最大值，并可以觀察到最大吸收峰。如果樣品溶液含有SOD，那么吸收峰會按照SOD的活性相應降低。

A, 0; B, 1; C, 2.5; D, 5; E, 10; F, 25; G, 50; H, 100; I, 250; J, 500ug/ml

SOD的抑制曲線可以由峰值的削減比率所得的抑制率來繪出。從抑制曲線可以看出，IC50為2.7ug/ml,絕對值為50 ng。該數值要比由批量法得到的20ng的值要大許多。

但是，FIA法能夠讓我們在一個小時內檢測出超過30個樣品，其檢測速度可以說是相當快的。我們用該方法檢測出了鼠紅血球的SOD活性，并將其與NBT法所得的數據進行了比較。

這兩種方法所得的數據是高度相關的，即便這是一種快速檢測方法，其結果與其他方法所得的數據還是相當一致的。

結論：

我們已經描述了SOD檢測的重要性以及幾種測定方法，隨著SOD的被發現，每年都會有各種各樣的檢測系統被發明。這個現狀告訴我們目前還沒有一個完全令人滿意的檢測方法。

我們所發現的SOD的檢測方法（WST-1法）是一種克服了許多常用方法中的常見問題的，頗具吸引力的檢測方法。為了將這種方法作為檢測SOD的標準方法，我們計劃調查作為O2-探針的WST-1的特異性。

本文譯自：Assay of Enzyme Superoxide Dismutase (SOD) 作者： Hiroyuki UKEDA, Ph.D. Department of Agriculture,Khochi University,200 Mononobe Otsu Nangoku-city, Khochi 783-8502,,Japan