一、 實驗目的 1．了解細菌有性雜交的原理，學習合作實驗，熟悉點菌。 2．掌握利用非中斷雜交法進行基因定位的原理，并利用實驗結果進行分析。 二、 實驗原理 F + 菌株：帶有F因子的菌株 F - 菌株：不帶F因子的菌株 Hfr品系：F因子整合入細菌染色體 F’菌株：由Hfr菌株染色體中F因子的不正常環出造成F’因子含有供體細胞的特定基因 其中，帶有F因子的菌株能夠與不帶F因子的菌株（F - 菌株）進行雜交進而發生基因重組。F因子一般游離于細菌染色體之外，也可能整合到染色體上，因此是一種被稱為附加染色體的質粒。帶有F因子的細菌，細胞表面會形成一種與細胞接合作用相關的毛狀突起，被稱為性纖毛，長約1-20μm。性纖毛促使供體和受體細胞特異地配對，在受體細胞上有纖毛的特異結合位點，當性纖毛結合到這些特異性位點之后，開始收縮并將2個細菌拉攏形成作為遺傳物質轉移通道的接合管，遺傳物質的轉移就開始了。 F + 菌株和F - 菌株雜交發生基因重組的頻率約為10 -7 ； Hfr品系，其和F - 菌株雜交時發生重組的頻率為10 -4 ；通過F’因子介導的供體菌向受體菌特定基因的轉移被稱為性導。 在雜交過程中，接合細菌可以在2小時中緩慢地進行遺傳物質的傳遞，在雜交不同時間進行強力攪拌，打斷接合細菌之間的接合管，從而終止遺傳物質的轉移。所以對應于轉移起點越近的基因進入受體菌的幾率越大，因此可以通過繪制基因的轉移曲線推斷出基因順序并以時間為單位進行染色體作圖，這種方法就是中斷雜交作圖。 本實驗采用的是非中斷雜交，不同的高頻重組品系（Hfr）中F因子與主染色體的整合位置是不同的。Hfr菌株與F - 菌株進行結合，染色體由Hfr向F - 轉移，由于染色體的轉移是單方向性的，染色體上的基因都是連鎖的，所以，位于Hfr染色體上前面的基因將有更多的機會出現在F - 中，越是后端的基因出現的機會就越少。因此，根據細菌結合后F - 菌中Hfr上的基因出現的多少就可以測定基因間的相對位置。實驗中采用選擇培養基篩選法，即親本不能生長，只有重組子可以生長，同時可利用營養物的加入選擇不同的重組子。 三、 ? 實驗用具及材料 1）菌株 供體菌：E.coli CSH60 Hfr str s 受體菌：E.coli 57B F - 缺陷型 met-leu-trp-his-arg-lac-gal-ade-ilv-str r??? 2）實驗 試劑 及培養基 1．液體BP培養基，10×A磷酸緩沖液 ，生理鹽水 ，200.0g/L糖溶液，0.25M硫酸鎂溶液，鹽酸硫胺素（VBI），鏈霉素溶液，氨基酸溶液及腺嘌呤 2．平板培養基：見表 1。 表 1培養基配表

將培養基配制完成后，在超凈工作臺將培養基倒入培養皿內制成平板，待培養基冷凝后備用。