常規修飾基團分子量

11.?如何溶解引物？?答：干燥后的引物質地非常疏松，開蓋前最好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或?10mM?Tris pH7.5?緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的?pH?值比較低（?pH4-5?）?,?引物在這種條件下不穩定。12.?如何保存引物？?答：引物合成后，經過一系列處理和純化步驟，旋轉干燥而成片狀物質。引物在溶解前，室溫狀態下可以長期保存。溶解后的引物?-20?度可以長期保存。如果對實驗的重復性要求較高，合成的?OD?數較大，建議分裝，避免反復凍融。修飾熒光引物需要避光保存。13.?合成的引物?5’?端是否有磷酸化?答：合成的引物?5’?為羥基，沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行?5′?端磷酸化，或者要求引物合成公司合成時直接在?5′?或?3′?端進行磷酸化，需要另外收費。14.?引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？?連接反應需要引物的?5’?磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。?SiRNA?分子具有特殊的對稱結構，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。15.?測序發現引物有突變是怎么回事？?答：測序發現引物區域有突變，特別是?40?個堿基以下的引物?,?發生的概率不大，但是肯定也會發生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列?COPY?到合成儀的，堿基輸錯的機會不多。核酸合成公司一般會有一套控制辦法，預防堿基輸入錯誤。發生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。引物合成是一種多步驟的化學反應，合成效率最高也就是?99%?，副產品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復，一般認為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發生丟失?DMT,?導致單體又接了上去，故發生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽?(capping)?反應不徹底造成的，?Caping?反應主要是封閉極少數?5′-?羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續參與合成。對于堿基置換的突變，產生的原因一般認為是堿基不能?100%?脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區域不能很好地與互補鏈配對，當擴增的產品被亞克隆轉化到大腸桿菌中，可能被細菌中修復系統補上了非配對的堿基。置換突變通常發生在?G?轉換成其它堿基。堿基?G?在一定條件下可以轉化為烯醇異構體?（脫嘌呤），?2,6 diaminopurine , DNA?復制和擴增過程中?DNA?聚合酶將?2,6 diaminopurine?看作堿基?A?，測序就會發現堿基?G-A?置換。脫嘌呤現象在富含嘌呤的引物中發生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解，測序就會發現堿基?G?或?A?的缺失。引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應用到規模化生產中。16.?長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？?答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到?100%?，產生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如?PCR?擴增，不可能絕對保證擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能保證?100%?正確。要知道，引物合成中發生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶?PCR?擴增過程所產生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。17.?如果測序發現突變，該如何處理？?答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯系，生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數據。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下，建議重新挑取克隆測序，可能會找到正確克隆的。根據經驗，?40?個堿基以下的引物，測?1-2?個克隆就可以了；?40?個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發現一段區域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。18.?引物是經過?PAGE?純化的，為什么還有堿基缺失或插入？?答：理論上分析型?PAGE?變性電泳，可以區分引物之間一個堿基的差別。但是制備?PAGE?電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內有一個不好的現象，?PAGE?純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少?OD?數，引物遇到的問題可能就會少一些。19. TaqMan?探針設計的基本原則是什么？?答：下列原則供您參考。◆?TaqMan?探針位置盡可能靠近擴增引物（擴增產物?50-150bp?），但不能與引物重疊。◆?長度一般為?18-40mer?。◆?G-C?含量控制在?40-80%?左右。◆?避免連續相同堿基的出現，特別是要避免?GGGG?或更多?G?出現。◆?在引物的?5’?端避免使用?G?。◆?選用比較多的堿基?C?。◆?退火溫度?Tm?控制在?68-70C?左右。有用的熒光染料參數

20.Primer?設計的基本原則是什么？?答：引物設計的下列原則供您參考。◆?引物長度一般在?18-35mer?。◆?G-C?含量控制在?40-60%?左右。◆?避免近?3’?端有酶切位點或發夾結構。◆?如果可能避免在?3’?端最后?5?個堿基有?2?個以上的?G?或?C?。◆?如果可能避免在?3’?端最后?1?個堿基為?A?。◆?避免連續相同堿基的出現，特別是要避免?GGGG?或更多?G?出現。◆?退火溫度?Tm?控制在?58-60C?左右。◆?如果是設計點突變引物，突變點應盡可能在引物的中間。21.?為什么引物的?OD260/OD280?小于?1.5?？?答：引物應該全是?DNA?，但是?OD260/OD280?的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質污染？引物化學合成，哪里有機會污染到蛋白質？需要指出的是?OD260/OD280?的比值不能用來衡量引物的純度。?OD260/OD280?的比值過低一般是由于引物中?C/T?的含量比較高所致。下表是一個?20mer?同聚體引物的?OD260/OD280?的比值，清楚表明?OD260/OD280?的比值與引物的堿基組成密切相關。A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

22.?同樣的?OD?用?PAGE?檢測，?EB?染色為什么深淺不一？?答：通常可以用?EB?染色的方法來判斷雙鏈?DNA?的量?(?如質粒?DNA)?，因為?EB?可以嵌合到雙鏈?DNA?中。而合成的單鏈?DNA?，由于堿基組成不同，形成二級結構的可能性不同，?EB?的染色程度也會有差異，比如?Oligo(dT)?等不形成二級結構，?EB?染色效果就非常差。所以不要用?EB?染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。同樣道理，用?EB?染色來照片不適合所有引物。23.?引物不純會有什么后果？?答：引物不純可能會導致：?1)?非特異性擴增；?2)?無法用預先設計在引物?5′?端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護堿基的引物；?3)?用于測序出現雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。24.?已經溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好?了？答：如果溶解引物的水?PH?過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反復凍溶。建議使用?10mM?Tris pH7.5?緩沖液溶解引物，因為有些蒸餾水的?pH?值比較低（?pH4-5?）?,?引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是?PCR?使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。25.PCR?擴增不出就引物有問題嗎？?答：基本不是。當今發展出各色各樣的?PCR?擴增技術，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決?PCR?擴增中遇到的擴不出、擴增效率低的問題。如巢式?PCR?就是擴增那些拷貝數很低的基因片段。?有些重復片段的擴增?, GC?含量高的片段，非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見（?1?）?RT-PCR?。請注意，很多基因通過常規?RT ?PCR?方法是很難擴增出來的。?RT- PCR?成功的關鍵在于?RT?的反應的?RNA?質量和目標基因在特定組織和細胞中含量。（?2?）從基因組中擴增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴格控制用量。基因組?DNA?過高，會影響反應體系中的?Mg?和?pH?。