1 導論

聚合酶鏈式反應（PCR）以其優越性極大地影響到了分子生物學的幾乎所有領域，并以其基本程序和DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis），開發出多種檢測核苷酸變異的方法。

RAPD（Random Amplifed Polymorphic DNA）就是其中的一種，它是1990年美國杜邦公司科學家J.G.K.Williams和加利福尼亞生物研究所J.Welsh領導的兩個小組幾乎同時發展起來的一項新技術。

Williams稱之為RAPD，Welsh叫它AP-PCR（Arbitrary Primer PCR）（Welsh J et al,Nucl Acids Res,1990(18):7213; Williams J G K et al,Nucl Acids Res,1990(18):6531）。

與常規PCR相比，RAPD主要有以下的自身特點：

①無需專門設計RAPD擴增反應的引物，也無需預知被研究的生物基因組核苷酸順序，引物是隨機合成或是任意選定的。引物長度一般為9～10個寡核苷酸。

②每個RAPD反應中，僅加單個引物，通過引物和模板DNA鏈隨機配對實現擴增，擴增沒有特異性。

③退火溫度較低，一般為36℃，這能保證短核苷酸引物與模板的穩定配對，同時也允許了適當的錯誤配對，以擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性。

④較之常規PCR，RAPD反應易于程序化。利用一套隨機引物，得到大量DNA分子標記，可以借助計算機進行系統分析。

RAPD作為單引物的PCR擴增產物，其產生機理是引物首先結合到模板鏈，沿模板5’端方向延伸而產生不同長度的DNA片段，然后以這些片段為模板繼續大量擴增。由于RAPD反應中，在3’端沒有相應引物和模板互補，這樣必然存在一個由引物沿模板DNA 5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互補序列的過程。

有人提出，在RAPD反應過程中，擴增可能存在一些這樣的分子模式：

①5’端帶有引物的單鏈DNA分子在3’端發生折轉、自身結合和延伸，并在3’端形成同一引物的互補序列，變性展開后即可成為單引物PCR擴增的模板分子。

②通過兩條5’端各帶同一引物的單鏈DNA分子拼聯來實現。

③對基因組DNA分子的顛倒重復序列而言，如果引物的結合位置正好處于這些序列的3’端，那么在其DNA片段的兩條單鏈上就分別具有一個引物的結合位置和它互補的序列，成了RAPD擴增的模板分子。

在雙引物通用PCR中這種情況很少，但由于RAPD所用引物短，又在低溫下退火，這增加了引物和顛倒重復序列結合的機會，完全有可能產生RAPD。

2 試驗條件

【藥品試劑】

模板DNA（10～100ng）

寡核苷酸引物（20mmol/L貯存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司購買，也可以自己合成）

0.2 mmol/L dNTPs（必須使用高質量的dNTPs，這一點非常重要。dNTPs經反復化凍后會發生降解，因此應分成小份保存。應注意混合物中四種dNTP的量要相等）

Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer,Norwalk,Connecticut）

10×PCR緩沖液（500 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2 ,100 mmol/L Tris HCl,pH 8.3）

礦物油

電泳所需試劑

【儀器設備】

PCR擴增儀

電泳裝置

微量離心機

微量移液器（1～20ml和20～200ml）

0.5 ml Eppendorf管

紫外線觀察裝置及照相設備

3 操作程序

1）在冰里向無菌的Eppendorf管中加入以下反應物：

水 14.75 ml

10×緩沖液 2 ml

10×dNTPs 2 ml

引物（20 mmol/L）0.2 ml

Taq DNA聚合酶

終體積

DNA（10～100ng）1 ml

石蠟油 20ml

（2）93℃反應2 min后開始如下循環：

93℃變性反應1min

36℃退火反應1min

72℃延伸反應1.5min

經過45個循環后，最后一個循環72℃增加5min，循環結束后反應產物置于4℃保存。

（3）20ml反應產物走凝膠電泳，經溴化乙錠染色檢測擴增的情況。

4 應注意的問題及其解決方法

（1）擴增偏差或無擴增。

在部分或全部管中缺少一個組分。重復少量幾個反應以確定所有的PCR組分是否都已加入。

PCR抑制物可能與DNA一起純化，改變DNA的濃度。

在DNA分離中加入一個清洗步驟（如苯酚抽提）。

稀釋新的DNA溶液。

引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物濃度。

延長退火時間（在PCR程序中的第二部分），或降低升溫轉換步驟之間的速率。

提高每個反應中的Taq聚合酶的濃度。

補加新的組分，該滅菌的都高壓滅菌。

（2）擴增結果差，條帶模糊或難以辨認。

更換Taq聚合酶緩沖液。

檢查引物（使用另外一個引物，或者將引物末端標記，在16% 6mol/L尿素聚丙烯酰胺膠上電泳檢測）。

檢查Taq聚合酶活性（與不同批量的酶作比較）。

改變DNA濃度。

（3）高相對分子質量產物彌散狀分布>4kb。

降低DNA濃度。

降低Taq聚合酶濃度。

減少凝膠上樣量。

可能是由于循環數過多的結果（Bell和Demarini 1991），減少循環數。

確認是否使用正確的緩沖液（不是水！）制備凝膠。

在較低的電壓下電泳。

（4）在對照和所有檢測樣品中均為一條很強的單一帶。

確認引物序列不是回文結構。這可能是引物多聚體造成的結果。使用不同的引物。

（5）帶譜不可重復。

DNA過多或過少。把基因組DNA濃度控制在10～100ng范圍之內，DNA量太少時，“真正”靶序列與引物的結合效率低，因此引物擴增會產生假的條帶，這就稱為引物偽跡；DNA量太多會導致錯誤配對（指引物與基因組DNA的配對）。每個樣品進行兩個不同DNA濃度的反應。

只考慮主要條帶。

（6）染色后凝膠背景太強影響分辨率。

減少染色時間。

凝膠脫色時間延長。

PCR反應中DNA含量或Taq聚合酶過多。

（7）低相對分子質量產物分離不充分。

在更高濃度的瓊脂糖凝膠、專業純凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上分離產物。

5 RAPD分析的優越性和不足

RAPD是一種全新且有效的遺傳標記，與其他分子標記相比，具有許多優越之處：

①合成一套引物，可用于不同生物基因組的分析。相對來說，RFLP標記具種族特異性，這限制了其應用。

②RAPD技術簡便易行，省力省時。不需要RFLP分析的預備工作，如克隆制備、同位素標記、Southern印跡和分子雜交。并且RAPD檢測靈敏方便，用熒光染料或同位素標記均可檢測，這大大增加了其分析速度。即使用序列膠來分析RAPD，單獨一人僅用36小時便能完成120個樣品的分析，而RFLP至少要花一周時間。

③RAPD分析所需樣品DNA量極少。僅為RFLP的1/1000～1/200，這對于生物早期取樣鑒定或DNA受限制的情況大有益處。

④由于RAPD用于構建基因圖譜時不需要克隆，這可打破克隆載體和宿主的限制，擴大了應用范圍。

⑤每個RAPD標記相當于基因組分析中的靶序列位點，這對共同協作的研究項目，可簡化信息的轉移過程。⑥RAPD標記可以對那些RFLP難以區分的基因組區域作出遺傳連鎖圖。⑦RAPD分析能自動化，減少了象RFLP那樣的麻煩手續。