Southern 雜交是分子生物學的經典實驗方法。其基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上，與標記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。

該項技術廣泛被應用在遺傳病檢測、DNA指紋分析和PCR產物判斷等研究中。但由于該技術的操作比較煩瑣、費時，所以現在有一些其他的方法可以代替Southern 雜交。但該技術也有它的獨特之處，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多態性(RFLP)的檢測等。

一、基因組 DNA 的制備（前述）

二、基因組 DNA 的限制酶切

　　根據實驗目的決定酶切DNA的量。一般Southern雜交每一個電泳通道需要10-30μg的DNA。購買的限制性內切酶都附有相對應的10倍濃度緩沖液，并可從該公司的產品目錄上查到最佳消化溫度。

為保證消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5μg /μl 為好。由于內切酶是保存在50%甘油內的，而酶只有在甘油濃度<5%的條件下才能發揮正常作用，所以加入反應體系的酶體積不能超過1/10。

具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入

DNA（1μg /μl） 20 μg 10×酶切buffer 4.0 μl 限制性內切酶（10U/μl） 5.0 μl 加ddH2 O 至 500 μl

在最適溫度下消化1-3hr。消化結束時可取5μl電泳檢測消化效果。如果消化效果不好，可以延長消化時間，但超過6hr已沒有必要。或者放大反應體積，或者補充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質，或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10 體積的0.5M EDTA，以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提，2.5倍體積乙醇沉淀，少量TE溶解（參見DNA提取方法，但離心轉速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丟失）。

如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應條件可以一致，則兩種酶可同時進行消化；如果反應條件不一致，則先用需要低離子強度的酶消化，然后補加鹽類等物質調高反應體系的離子強度，再加第二種酶進行消化。

三、 基因組 DNA 消化產物的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，制備簡單，分離范圍廣（200bp-50kb），實驗成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA片段范圍。

表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍

1. 制備0.8%凝膠：一般用于Southern雜交的電泳膠取0.8%。

2. 電泳：電泳樣品中加入6×Loading 緩沖液，混勻后上樣，留一或兩泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA從負極泳向正極。電泳至溴酚藍指示劑接近凝膠另一端時，停止電泳。取出凝膠，紫外燈下觀察電泳效果。在膠的一邊放置一把刻度尺，拍攝照片。正常電泳圖譜呈現一連續的涂抹帶，照片攝入刻度尺是為了以后判斷信號帶的位置，以確定被雜交的DNA長度。

四、DNA從瓊脂糖凝膠轉移到固相支持物

轉移就是將瓊脂糖凝膠中的DNA 轉移到硝酸纖維膜（NC膜）或尼龍膜上，形成固相DNA。轉移的目的是使固相DNA與液相的探針進行雜交。常用的轉移方法有鹽橋法、真空法和電轉移法。這里介紹經典的鹽橋法（又稱為毛細管法）。

（一）試劑準備

１．變性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl。

２．中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl;

３．轉移液（20×SSC）： NaCl 175.3g; 檸檬酸三鈉82.2g，NaOH 調pH 至7.0，加ddH2 O至1000ml。

（二）操作步驟

1.堿變性:室溫下將凝膠浸入數倍體積的變性液中30min。

2. 中和: 將凝膠轉移到中和液15min。

3．轉移 按凝膠的大小剪裁NC膜或尼龍膜并剪去一角作為標記，水浸濕后，浸入轉移液中5min。剪一張比膜稍寬的長條Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。按下圖所示進行轉移。（ 轉移過程一般需要8-24hr，每隔數hr換掉已經濕掉的紙巾。轉移液用20×SSC。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個操作過程中要防止膜上沾染其他污物。）

4. 轉移結束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液數min，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間，80 ° C烘2hr，然后將NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。

五、探針標記

進行Southern 雜交的探針一般用放射性物質標記或用地高辛標記。放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。這里介紹放射性標記。 探針的標記方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法，有一些試劑盒可供選擇，操作也很簡單。

以下為Promega公司隨機引物試劑盒提供的標記步驟：

1．取25-50ng模板DNA于0.5ml離心管中，100℃變性5min，立即置冰浴。

2．在另一個0.5ml離心管中加入：

Labeling 5×buffer 10μl （含有隨機引物） dNTPmix 2μl (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM) BSA（小牛血清白蛋白） 2μl [ a -32 P]dATP 3μl Klenow酶 5U

3．將變性模板DNA加入到上管中，加ddH2 O至50μl，混勻。室溫或37℃ 1hr。

4．加50μl 終止緩沖液終止反應。

標記后的探針可以直接使用或過柱純化后使用。由于 a -32 P的半衰期只有14天，所以標記好的探針應盡快使用。探針的比活性最好大于109 計數/分/μl。

六、雜交

Southern 雜交一般采取的是液-固雜交方式，即探針為液相，被雜交DNA為固相。雜交發生于一定條件的溶液（雜交液）中并需要一定的溫度，可以用雜交瓶或雜交袋并使液體不斷的在膜上流動。雜交液可以自制或從公司購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。下面給出的為一雜交液配方：

PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。 該雜交液的雜交溫度為42℃。

1．預雜交

NC膜浸入2×SSC中5min，在雜交瓶中加入雜交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放入42℃雜交爐中，使雜交體系升到42℃。取經超聲粉碎的鮭魚精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加熱變性5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達到100μg/ml。繼續雜交4hr。鮭魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉移的位點，降低雜交背景、提高雜交特異性。

2．雜交

倒出預雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42℃的雜交液，同樣加入變性的鮭魚精DNA。將探針100℃加熱5min，使其變性，迅速加到雜交瓶中。42℃雜交過夜。

七 、洗膜與檢測

取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜： 2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min； 1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min； 0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min； 0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min； 0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。

在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。實踐證明，當放射強度指示數值較環境背景高1-2倍時，是洗膜的終止點。上述洗膜過程無論在哪一步達到終點，都必須停止洗膜。

洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，并用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏），在暗室的紅光下，貼覆兩張X光片，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70 ℃ 低溫冰箱中曝光。根據信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天時間。洗片時，先洗一張X光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時間，再洗第二張片子。

影響Southern雜交實驗的因素很多，主要有：DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉移效率、探針比活性和洗膜終止點等。

八、注意事項

1. 要取得好的轉移和雜交效果，應根據 DNA 分子的大小，適當調整變性時間。對于分子量較大的 DNA 片段（大于 15kb ），可在變性前用 0.2M HCl 預處理 10min 使其脫嘌呤。

2. 轉移用的 NC膜要預先在雙蒸水中浸泡使其濕透，否則會影響轉膜效果；不可用手觸摸NC膜，否則影響DNA的轉移及與膜的結合。

3. 轉移時，凝膠的四周用Parafilm蠟膜封嚴，防止在轉移過程中產生短路，影響轉移效率，同時注意NC膜與凝膠及濾紙間不能留有氣泡，以免影響轉移。

4. 注意同位素的安全使用。