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變性梯度凝膠電泳 主要分離原理是利用DNA鏈的熔解性質達到分離目的，低熔點和高熔點的DNA局部解鏈的程度不同，分子的遷移速率不通過，進而分離。

一、實驗原理

變性梯度凝膠電泳 (DGGE)是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱之為變性。核酸50%發生變性時的溫度稱為熔解溫度(Tm)。Tm值主要取決于DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下：溫度50~60 ℃，變性劑0~100%。當一雙鏈DNA片段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時，此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當于此段DNA的低熔點區的Tm值，此區便開始熔解，而高熔點區仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發生改變，達到分離的效果。Tm的改變依賴于DNA序列，即使一個堿基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以及少于10個堿基的缺失突變。

為了提高DGGE的突變檢出率，可以人為地加入一個高熔點區——GC夾。GC夾(GC clamp)就是在一側引物的5′端加上一個30~40bp的GC結構，這樣在PCR 產物的一側可產生一個高熔點區，使相應的感興趣的序列處于低熔點區而便于分析。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%。

作為一種突變 檢測技術，DGGE具有如下的優點：(1)突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。(2)檢測片段長度可達1kb，尤其適用于100~500bp的片段。(3)非同位素性。DGGE不需同位素摻入，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。(4)操作簡便、快速。DGGE一般在24小時內即可獲得結果。(5)重復性好。但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴。

二、實驗用品

1.PCR擴增儀;變性梯度凝膠電泳儀 ;凝膠成像及分析系統;紫外透射儀;高速離心機;電泳儀;電泳槽。

2.尿素、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、瓊脂糖

3.微量加樣器(200μl，20μl);Tip頭(200μl，20μl)。Tip頭盒(200μl，20μl);Eppendorf管(0.5ml，0.2ml)，Eppendorf管架。

4.PCR擴增相關試劑

三、實驗步驟

1.PCR反應(同前)

其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。

2.PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認。

3.垂直變性梯度凝膠電泳

變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0～100%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的最適解鏈條件(即變性濃度)。

PCR產物加上樣緩沖液后上樣，300～400μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間2～4小時。

4.平行變性梯度凝膠電泳

變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區域的變性濃度，制備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測各標本是否存在突變。

PCR產物加上樣緩沖液后，25μl～30μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間3～6小時。

5.染色5分鐘，凝膠成像儀分析結果。

注意事項： 變性梯度凝膠電泳實驗中操作中所使用的實驗藥品和試劑很多都有毒，且具有致癌、變性等毒害作用，一定要嚴格按操作步驟，保護自己免受實驗傷害。