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膠回收

一. 提高膠回收量的辦法：

1) 增加電泳時的上樣量。

2) 電泳緩沖液用新鮮配制的。

3) 切膠時盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。

4) 把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個管子，轉移到同一個柱子上。

5) 溶膠時所加的溶液可多一點，這樣更有利于DNA與膜的結合，不過一般不要多余750ul。

6) 膠回收的關鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30％異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。

7) 加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發。

8) 最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫（不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結合在膜上的DNA。

9) 可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯。

10) 將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。

二. 幾種PCR 產物回收的詳方法和步驟

1) 普通膠回收

如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可。另外好像還有冷凍法，沒作過，不是很清楚。

2) 從低熔點凝膠回收DNA

純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結構分析，探針制備等）。

3) 擴增特異性好的PCR回收

如果PCR擴增特異性好，只是簡單的PCR產物純化回收，可以在PCR產物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無水乙醇沉淀回收。

三. 不需膠回收就可直接連接的方法

1) 低溫冷凍析出法

跑電泳時用低熔點的agarose膠，跑到一定時候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒有脫氧核酸的那點膠也盡量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負75度冰箱中10－30分鐘，接著1，300rpm離心5－10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲存在另一個管子中，做好標記，放在－20度備用。

2) 酶切后的直接連接

在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進行連接是可以篩選出連接好的片斷的.

四、一些注意事項

1.電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源DNA污染。

2.切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。

3.關于防護，在一般有機玻璃后就足夠了，戴上防護面具以保護眼睛，如果你戴樹脂眼鏡就可以了。

4.瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環境中（如果用柱子的話）。對于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%異丙醇。

5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標記的探針用X片，未標記的用EB。

6.選用回收效率較高的柱子，比如進口的Qiaquick spin column。

7.參照分子克隆用低熔點膠回收。除低熔點凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。

附注：

1．影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：

1)DNA分子大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結構重復性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結構緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）

2) 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質阻滯系數。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA

Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb

1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.

3)DNA構象：一般遷移速率超螺旋環狀>線狀DNA>單鏈開環。當條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關。

4)所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5V/cm

5)堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 ℃

6)嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)

7)電泳緩沖液 （0.5×TBE）的組成及其離子強度影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2．溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。

3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenol blue, Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。

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