DNA 和蛋白質電泳分離的定量熒光分析

摘要：在生命科學領域中，UV透視法是一種廣泛使用的工具。許多用于蛋白和核酸電泳分離后染色的熒光染料在UV區域內有著顯著的激發峰，因此中等范圍的UV 波長成為大多數用于高靈敏分析的熒光素的激發波長。然而由于通過UV光盒表面的光照度缺乏均一性，定量分析往往受到限制。這里介紹的光照系統通過使用可以提供通過成
像表面的變化系數（CV）<6％的光照均一性的電子穩定器和可調的磷涂層，發展了一種高強度的光照體系。該體系可以專門解決上述問題。

Quantitative Fluorescent Analysis of DNA and Protein
Electrophoretic Separations

Sean R. Gallagher

Abstract: UV transillumination is a widely used tool in life science research. Many fluorescent stains used in postelectrophoretic protein and nucleic acid analyses have significant excitation peaks in the UV region, making mid-range UV the excitation source of choice for high-sensitivity analysis of most fluorophores. However, often quantitative analysis is limited by the lack of uniformity of the illumination across the surface of the typical UV light box. The transilluminator described here has been designed specifically to address this issue through the development of a high-density lighting system using an electronic ballast and a tuned phosphor coating, which provide uniformity of lighting of <6% coefficient of variance (CV) across the imaging surface.

        在生命科學研究領域中，UV 透視法是一種普遍使用的工具。幾乎沒有例外，許多用于蛋白和核酸電泳分離后染色的熒光染料在UV 區域內（300~350nm）有著顯著的激發峰，因此中等范圍的UV 波長成為大多數用于高靈敏分析的熒光素的激發波長。然而由于通過UV 光盒表面的光照度缺乏均一性，定量分析往往受到限制。此篇應用性文章詳細地描述了具有高度均一性的302nm UV 透視系統，FirstLight^TM UV 光照裝置（UVP, Inc., Upland, CA）(見圖1)。它通過發展一種使用電子穩定器和可調磷涂層的高強度光照體系，可以提供通過成像表面變化系數（CV）< 6 ％的光照均一性。從而使采用UV 光照系統進行定量和重現性地分析分離蛋白質和DNA 成為可能。

CCD成像與UV 光照系統

        如今，在生物研究實驗室中，針對相關生成文件和電泳分離分析的數碼熒光成像技術發展十分迅速^[1]。其應用囊括了蛋白和DNA 凝膠相關文件的生成和分析^[2~5]。隨著冷卻的低光強和高分辨電荷耦合設備(CCD)照相機^[1]的引入，CCD 捕獲技術已經成為一種可替代基于激光掃描方法的誘人的技術。

        數碼熒光CCD 成像有許多優點，包括： 

• 相對于激光掃描成本低
• 檢測靈敏度高
• 動態范圍寬
• 低噪音CCD 照相機捕獲信號速度快（通常從ms 至s）

        對于蛋白和核酸的分析有很多高靈敏的染料。幾乎沒有例外，許多用于蛋白和核酸電泳分離后染色的熒光染料在UV 區域內有著顯著的激發峰，因此中等范圍的UV 波長成為大多數用于高靈敏分析的熒光素的激發波長^[5]。

        蛋白質的快速熒光多元分析（從單塊凝膠中獲得若干熒光信號）大大地簡化了在一維或二維十二烷基磺酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，蛋白表達、轉錄和轉譯后的修飾分析^[4,5]。

        然而由于常用UV 透視系統均一性的缺乏，通過紫外可見CCD 成像進行定量便成為一個難題。精確重現的UV 成像需要均一穩定的光源。

        均一的光照系統對于定量分析非常重要，它能夠保證：

• 穿越光照表面始終如一的靈敏度和動態范圍
• 很少或不依賴可以導致低信號數據丟失的均一性校正軟件
• 直接進行膠之間的對比

UV光照系統的表征

        通過CCD 直接成像的強度輪廓、UV 傳感器探測光照系統表面的輪廓以及使用染色的經電泳分離的樣品,可以對FirstLight 光照系統進行表征。

        成像捕獲方法需要使用以下產品：AC1 AutoChemi 暗房，與FirstLight UV 光照系統相對的8W 光照體系，BioChemi 冷卻12 位CCD 照相機，LabWordsTM 4.5 軟件（均來自UVP，Inc.）。將8.5mm.1:1.5 電視透鏡安裝到BioChemi 照相機上用于捕獲影像。曝光調至150ms（進倉調至4），光圈調至能夠給出全范圍的信號。計算的CV 適合整個濾光器表面（全部區域）和距每個邊緣處1cm 的區域（內部區域）^[6]。

        由于獨立地直交地測量均一性，我們將帶有UV 探針的光照系統安裝于X-Y 軸平臺上。該平臺可以在整個表面區域移動，在整個濾光器表面指定的位置獲取數據。光圈圓錐體安裝在一個帶有300nm 傳感器的UV 儀上。整個組合再安裝到X-Y 軸平臺上，光圈到濾光器表面的距離為1mm。X-Y 軸平臺按設定的程序在光照系統濾光器的表面移動，分別在每100個均等的空間點上停留3s。在每一個點處，儀器將會測量UV 強度， 并且輸出到Excel (Microsoft, Redmond, WA)中計算CV。

        FirstLight 光照系統是一種高度均一的激發光源，可用于很寬范圍的基因組與蛋白組的定量熒光成像分析，包括：

• 電泳分離和蛋白質的一維二維電泳的定量
• DNA 定量
• RNA 定量該系統使得定量UV 多譜段的熒光CCD 成像成為可能。

參考文獻

1. Medberry S, M o o m a w B , Gallagher SR. Digital electrophoresis analysis. In: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al., eds. Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley & Sons 2004.
2. Gallagher SR. One-dimensional SDS gel elec- trophoresis of proteins. In: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al., eds. Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley & Sons 2003.
3. Gallagher SR, Winston SE, Fuller S, Hurrell JGR. Immunoblotting and immunodetection. In: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al., eds. Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley & Sons 2004.
4. Patton WF. Detection technologies in proteome analysis. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci 2002; 771(1-2):3-31.
5. Haugland RP. Handbook of fluorescent probes and research products. Eugene, OR: Molecular probes, 2003.
6. Steele RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics, 2nd ed. New York: McGraw-Hill Book Co., 1980.
7. Sasse J, Gallagher SR. Staining proteins in gels. In: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al., eds. Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley & Sons, 2003.