毛細管凝膠電泳的DNA片段分析和制備

摘要：本文闡述了自動毛細管凝膠電泳微制備分離DNA片段的適用性，該方法具有高分離度、高效、聚合物可以更換及多光學檢測模式的特點，并成功進行了納摩爾級的cDNA收集和克隆。

Abstract:The applicability of automated capillary gel elecffophoresis is demonstrated for the micropreparative separation of DNA kagments. The procedure provides high-resolution, high-yield separation and uses replaceable polymer networks and multispecual detection modes. Nanomolar quanddes of cDNA amplicons are collected and subsequent cloning operations were successfully conducted.

        凝膠電泳已有幾十年的發展，主要應用于生物大分子的分析，如DNA、蛋白質及糖。傳統的凝膠電泳分離DNA分子是使用瓊脂糖或交聯聚丙烯酰胺在棒或平板凝膠電泳上實現的^[1]。在過去的10年里，建立起使用電場的自動、高效的毛細管電泳分離方法，如毛細管凝膠電泳(CGE)^[2]和凝膠微器件^[3]為電泳提供儀器化方法。該項新技術具有快速分離和對生物大分子分離能力強等特點。除使用高粘度交聯的高分子作為篩分介質外，也可使用低粘度線性的聚合物，如非交聯聚丙烯酰胺、衍生化的纖維素、聚氧化乙烯。后者在每次運行時可更換篩分介質(如毛細管或芯片)^[4]。毛細管電泳通常被認為是分析的工具，但它們也能在微制備方面應用。在CGE發展的早期，收集少量的低聚核苷酸用于下一步分析，如Dot-blot分析^[5]，這方面研究已有報道。CGE被用于從對應變異聚合酶鏈反應產物的變性DNA多個峰中收集餾分，然后利用PCR再擴增和用CGE重新分析^[6]。在大部分報道中，在組分收集的過程中保持電場強度恒定，但由于其高效性和快速分析。DNA毛細管凝膠電泳的譜峰非常窄，通常為亞秒級。這對于精確的樣品收集顯得時間過短。因此，Karger和其同事^[7]過電場程序測定的方法可使該問題得到緩解，即在樣品收集的過程中降低電場強度。最近。該小組建立了一種12根毛細管系統，可全自動收集上百種餾分，在分離和收集的過程中無需使電場中斷^[8]。本文旨在闡明采用可更換的聚合物篩分介質和多種光學檢測模式，使毛細管凝膠電泳具備了快速和高效分離DNA片段的可行性。在微制備操作模式下，可收集納摩爾級的DNA餾分，以備下一步之用，如克隆。

1實驗

　　在整個實驗中，P／ACE-MDQ(Beckman Coulter公司)均在反電極分離模式下(陽極在檢測端)使用，在紫外254nm處或激光誘導熒光柱上檢測。后者在多光譜成像模式下(multispectralimaging modes)使用綠氬離子和紅二極管激光。通過液控裝置，毛細管溫度控制在25．0± 0．1℃。P／ACE MDQ軟件用于采集和分析數據。所有的樣品均采用電泳進樣：6kV x10?60s。餾分采集可根據預先指定的時間窗口手動或者根據系統的實時峰檢測自動收集一個或者多個餾分。

　　多種合適濃度的不同分子量的聚氧化乙烯(PEO)溶液可用于篩分介質。對于單鏈DNA的分析，20％PEO(分子量為20，000)溶解在1x TBE緩沖液中(89mmol／L Tris，89mmol／L硼酸，2mmol／L EDTA，pH 8．4)，對于雙鏈DNA的分析，0．75％或者2．5％PEO(分子量為600。000)溶解在1x TBE緩沖液中，整個實驗的運行緩沖液為1x TBE。單鏈的低聚核苷酸試劑盒購自Sigma公司。標記有Cy5具有50堿基對的dsDNA來自Pharmacia。The 70?400tetramethyl?rhodamine(TMR)一labeled sizing ladder購自PerkinElmer，Sybr綠色熒光染料購自Molecular Probes，其他試劑均來自ICN Pharmaceuticals，樣品溶液和緩沖液在使用前均用0．2μm濾膜過濾。

2結果與討論

2．1 PCB引物純度的快速監測

　　圖1為使用高濃度20％的PEO(分子量為20，000)溶液作為篩分介質快速和自動分析20?60堿基對的低聚核苷酸標準品。可以看出在紫外254nm處檢測已經滿足需求。對于微量樣品，為提高檢測靈敏度，可選用激光誘導熒光檢測，柱前共價鍵合熒光標記物。對于單鏈的DNA小分子，無法使用非共價的熒光標記物，由于紫外檢測無需鍵合熒光標記物，因此有時仍是理想的選擇。從圖1中可以看出，在6min內可以完成PCR引物的分析。圖l b?g中只有對應于b，d，f和g的PCR引物被考慮進一步擴增，而c和e的PCR引物在進行PCR之前需重新合成和分析。在96孔樣品盤、全自動毛細管電泳系統上每天可分析144個引物，從而保證用于PCR及下游處理的引物的可靠性及潔凈度。

2．2雙鏈DNA片段的高效分離和多光學分析系統

　　除單鏈DNA分子階快速分析外，同時也介紹了采用多光學激光誘導熒光檢測器模式對雙鏈DNA片段的高選擇性分離。圖2為雙通道成像裝置，它顯示通過光導纖維氬離子和紅二極管激光綜合光束照射到毛細管的檢測位置，由球形棱鏡采集熒光信號，發射光由分色鏡分成50／50％的光束。

　　圖3為采用488nm激光分離TMR-標記的dsDNA，峰上的數字對應于片段的大小，插入的圖為分離片段的S型標準曲線(片段大小對遷移時間)，該曲線可使未知組分片段大小測定的相對標準誤差在5％以內。為提高片段大小測定的準確性，應使用多光學檢測器，將被Cy5標記的50堿基對的ladder與TMR標記的片段同時進樣，這樣在片段大小測定方面不但可獲得高的準確度，也可以精確地計算出餾分收集情況。基于毛細管凝膠分離系統的優異的分離能力與兩種熒光標記物(在568與670nm處發射)良好的光譜分辨率，可使PCR、限制片段長度多態性(RFLP)^[9]和擴增片段長度多態性(AFLP)的產物更加快速和可靠，后者的例子如圖4所示。圖4為TMR衍生的AFLP片段與Cy5標記的ladder標準物的電泳圖。AFLP圖在20min左右有幾個重疊峰，可能對應于引物和二聚體，目標峰是在長時間區的小峰。

　　將高通量分離系統用于檢測分析時，在CGE中的多檢測器是非常有效的，在該種情況下，使用制備型、粗內徑的單根毛細管裝置時，同時進樣大小合適的標準品(即50個堿基對的Cy5衍生的ladder)以便能精確地收集相關的組分。當目標峰被ladder標簽夾在中間時，全自動采集的精確度可顯著提高。

2．3為下游處理而進行的片段收集

　　圖5是為下一步克隆而進行的自動毛細管凝膠電泳純化1650堿基對擴增產物的譜圖。圖5a為cDNA樣品在內徑為180μm的毛細管內的分離譜圖。雙箭頭顯示收集時間區，根據目標峰的遷移時間，可在22．5和25．5min內通過簡單的更換毛細管出口端儲瓶來實現。需說明一點的是，在樣品收集的過程中電場強度未發生任何變化。圖5b是由進樣采集的餾分而獲得的譜圖，從而可以證明全自動餾分收集方法的可靠性和精確性。因此高通量分析和樣品收集可用全自動的形式設定，也可用96孔樣品盤的形式。

　　收集的cDNA片段的高純度(圖5b)可保證克隆實驗的順利進行(見圖6)，第一步為反轉錄，即將mRNA轉換為cDNA^[10]，然后通過PCR擴增cDNA，反應產物通過上述的CGE制備方法純化，只將純的產物注射到細菌細胞核內的質體中，重組體DNA質體通過DNA吸收進入到細菌內部^[11]，表達克隆的DNA，即產生相應的蛋白。

3結論

　　作者采用可替換的聚合物作為篩分介質和多光學檢測模式，用于高分離度和高產率的DNA片段的分析和制備的全自動毛細管凝膠電泳。CGE優異的分離能力可分離大小相似的DNA分子，并可精確收集目標餾分以備下一步之用，如克隆。微制備的毛細管凝膠電泳具有分離度高、速度快、回收率高、可全自動等優點。收集的納摩爾級的cDNA已被成功克隆。多光學激光誘導熒光檢測法可提高收集過程的精確度。

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