整體柱HPLC-DAD 法快速測定動物飼料中的九種藥物
摘要:最近幾年,歐盟立法對飼料中的化學藥品添加授權。因此,必須建立一些分析方法來分析飼料以保證與法律規定相符。本文給出一種適合于分析濃度低于1 mg/ kg(這是消費者可以接受的限量)的化學藥品,應當被接受為保護消費者安全的方法。此新方法采用一根整體柱,它能明顯降低HPLC的分析時間。這一方法可節省分析時間,同時可簡化樣品制備程序,有利于大體積樣品的實驗室分析使用。
Abstract:Authorization of the use o many chemotherapeuticals as feed additives has been withdrawn by the EU legislation in recent years. Accordingly, methods are needed to analyze feed stocks to ensure legal compliance. The method proposed in this paper is shown to be suitable for analyzing chemotherapeuticals down to the level of 1 mg/kg, which is an acceptable limit for the protection of consumers. This new method employing a monolithic column has the advantage of reducing the HPLC separation time significantly. This improved time-saving and the simple sample preparation procedure will be beneficial for laboratories with high sample volumes.
在歐洲,藥物被廣泛用作飼料添加劑以防止和控制禽畜疾病[1]。近年來,歐洲已經立法提出對大部分藥物的添加加以限制。
本文發展了一種采用整體柱HPLC-DAD(二極管陣列檢測)法同時測定飼料中喹乙醇、卡巴氧、尼卡巴嗪、呋喃妥英、硝基糠腙、呋喃它酮、呋喃唑酮、硝呋柳肼和洛硝達唑等9 種藥物的方法。該方法基于2000 年意大利國家動物飼料控制計劃[2]中提供的分析方法。
洛硝達唑用來控制家禽中的黑頭病和防止病原體及微生物對豬的感染。洛硝達唑在70/ 524/EEC 及98/ 19/ EC 中被取締[3]。
硝基呋喃類藥(呋喃妥英、硝基糠腙、呋喃它酮、呋喃唑酮和硝呋柳肼)均為抗菌類藥物,添加在動物飼料中可促進其生長,同時能控制和防治一些細菌和病原體的感染,如家禽霍亂和球蟲病等。
硝基呋喃類藥物為管理規則附錄四中禁止的抗生素類藥(2377/1990)[4]。除了硝呋柳肼外,其他硝基呋喃類藥物于2003年3月31日在歐洲全部被禁用;此后的管理規則(EC)1756/2002 中也被進一步提及禁用[5]。
卡巴氧是一種抗菌類藥物,曾作為飼料添加劑用于防治豬痢疾和小豬的細菌腸炎[6],同時也被作為生長促進劑使用。喹乙醇是一種合成的豬生長促進劑。這兩種化合物被歐洲委員會在(EC)2788/98[7]中被禁用。所有這些取締規定的提出基于其在動物體內原始殘余量對消費者健康的危害程度決定。
尼卡巴嗪是4,4’- 二硝基苯氨基甲酰和2-氫氧基-4,6’- 二甲基嘧啶的等當量復合物,作為家禽和兔類的抗球菌類藥物被使用。
目前,根據1831/ 2003[8],尼卡巴嗪被允許作為肉用禽類和幼雞的飼料添加劑,但對其用量有嚴格限制。其他情況下,根據(E C)2 2 0 5 /2001[9]均被禁止使用。
從20 世紀50 年代開始,已經發展了多種用于測定飼料中藥物的方法,包括薄層色譜法[10]、比色測定法[11]以及HPLC/ UV、HPLC/ MS 等[12-15],這些方法對于測定動物飼料中的本底殘留量,保護消費者的健康起到了積極的作用。但這些方法均不能同時測定本文所涉及的所有藥物。
本文發展了一種使用整體柱HPLC 測定飼料中藥物的方法。
1 實驗部分
1.1 藥品和溶劑
丙酮(99.8%)、二氯甲烷(9 9.5% )、甲醇(99.9%)、二甲基甲酰胺(99.8%)以及醋酸鈉(99.5%),均為分析純試劑(Carlo Erba,Milan,Italy)。乙酸(100%)為分析純試劑(Prolabo, Paris, France)。乙腈(99.9%)為色譜純試劑(Carlo Erba)。
標準品和H P L C 的流動相采用Milli-Q(Millipore, Bedford, MA)高純水配制。液相色譜的流動相先經過0.45 μm 膜(Millipore)過濾,經過純化的樣品在進入液相色譜分析前也需通過17mm、0.45μm 的尼龍網過濾。Al-N 固相微萃取裝置是由IST 公司(Mid Glamorgand, U. K.)提供的。
1.2 儀器
旋轉蒸發儀(Büchi, Flawil, Switzerland),帶有加熱裝置的氮氣旋轉蒸發儀(Liebisch,Bielefeld,Germany)。HPLC 系統由一個P4000的四元梯度泵、帶有Rheodyne 7125 型進樣閥
(Cotati, CA)的AS 3000 自動進樣器、SCM 1000流動相脫氣機和UV 6000LP 二極管陣列檢測器構成。(除了7125型進樣閥外,其余均來自Thermo Electron, San José,CA)。
HPLC 色譜柱為Chromolith SpeedROD RP-18e柱,50 mm × 4.6 mm i.d. (Merck, Darmstadt,
Germany)。柱溫箱溫度:30 ℃。HPLC 流動相A 為濃度0.05 mol/L 的乙酸緩沖液(pH 4.5);流動相B 為純乙腈。整個分離過程可在6 min 內完成,梯度程序見表1,流速5 mL/min。對洛硝達唑和卡巴氧,二極管陣列檢測器的檢測波長設定為320 nm;對呋喃妥英、硝基糠腙、呋喃它酮、呋喃唑酮、硝呋柳肼、喹乙醇和尼卡巴嗪,檢測波長設定為365 nm。
1.3 標準溶液
喹乙醇與硝基糠腙購自M P 生物醫藥公司(Irvine, CA);洛硝達唑,卡巴氧和尼卡巴嗪購自Sigma(St. Louis, MO);呋喃妥英,呋喃唑酮,呋喃它酮購自Riedel de Haen(Seelze,Germany); 硝呋柳肼購自Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany)。用二甲基甲酰胺配制成1.0 mg mL-1 的儲備液。將這些儲備液存儲在-20 ℃(除尼卡巴嗪在+4 ℃)不超過3 個月。濃度依次為50.0,25.0,10.0,5.0,2.0,1.0,0.5,
0.1 μg mL-1 的標準溶液,在每天實驗前用甲醇/水(60:40,v/v)稀釋儲備液后得到。
1.4 樣品制備
將5g 顆粒狀飼料置于塑料杯中,加入50 mL的二氯甲烷/ 丙酮溶液(1/1,v/v),蓋緊瓶蓋,在搖床上搖勻1h。然后將溶液在3500r/min 條件下離心15 min,取出2 mL。在50 ℃用氮氣將樣品吹干。再將殘余的樣品溶于1mL 甲醇/ 水(80:20,v/v)溶液中,用于固相微萃取純化。
將上述1mL 提取物通過Al-N 固相微萃取柱純化。先用3mL 甲醇和5mL 甲醇/ 水(80:20,v/v)溶液清洗萃取柱。樣品采用4mL 60%甲醇和4mL 100% 甲醇洗脫,洗脫液被收集在10mL 的試管中。
經過純化的樣品在50 ℃條件下用氮氣流吹干后復溶于0.5mL 的60% 甲醇溶液中,通過尼龍網過濾。HPLC 進樣量20μL。為了對發展的方法加以認證,在空白的雞飼料中加入一定量的藥物配制成標準溶液,具體方法為:在5g 的飼料中分別加入5,10 和25μL 的藥物,得到的樣品中藥物濃度分別對應為1,2 和5mg/kg。在進行提取之前,添加藥物的樣品可在遮光、室溫條件下穩定存放1h。
2 結果和討論
混合標準樣品的色譜分離圖見圖1。由365和320 nm 的疊加譜圖可以看出,此方法中不同分子在不同波長處有不同的響應值,由此可以獲得最大的檢測靈敏度。由譜圖也可以看到,使用整體柱分析可以在很短的時間內獲得較好的分離效果。
本方法線性回歸曲線在最佳波長處測定。各被測藥物的濃度與其色譜峰面積都有很好的線性關系(除了尼卡巴嗪,其他藥物的相關系數均大于0.998)。結果在表2 中給出,每一實驗重復3 次。
采用所發展的方法,對空白的雞飼料分成3個不同級別實驗(1,2 和5mg/kg),每個實驗做6 個樣品。圖2 顯示了空白飼料和相同的家禽飼料在1 mg/kg 時的疊加色譜圖。在本文研究的工作中,可以證明被研究的藥物組分在保留時間附近沒有干擾峰。根據2005 PNAA[16],我們也研究了其他飼料(小牛和豬的飼料),其色譜圖與家禽飼料相似。
在質量濃度為1 到5 mg/kg 范圍內,通過每次實驗運行6 個樣品,以空白飼料為樣品研究平均回收率和重復性。結果發現回收率為53% 到98%,相對標準偏差(CV)低于10%。回收率和日內重現性都滿足要求。
通過文獻[17]提供的計算方法,以質量濃度為1 mg/kg 的樣品為實驗樣本,根據該樣品的6次重復實驗結果計算檢測限(LOD):
LOD=t (0 .9 9)× S D
這里t (0.99)表示在99% 置信度和(n-1)自由度時的t 值,SD 表示重復分析時的標準偏差。
定量限(LOQ)是指在特定精確度(重復性)條件下,可以測定的最低樣品濃度。CV值小于10% 時,精確度可以接受;這樣,對于所有藥物樣品,LOQ 被認定為1 mg/kg,相關數據被列于表3 中。
3 結論
本方法適合于分析濃度低至1 mg/ kg 的藥物,這一檢測限可以滿足大多數樣品的分析要求。所發展的方法的最大優勢為可以大大減少分析時間,非常適合于需要分析大量樣品的實驗室。再者,由于樣品的制備簡單易行,此方法可以取代目前正在采用的那些復雜的方法。
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