采用GC/MSD DRS對殘留農藥進行全面篩查

前言

　　根據農藥手冊，目前世界上正在使用的農藥有700多種[1]。大約600種農藥是過去使用的，但現在已經禁用或不再銷售。有一些農藥早已不再使用，但它們仍然存在于環境中，還可能在植物和動物體內生物富集。在食品和飲料、在土壤、水和大氣、在水生和陸生的動植物、在人類血液、脂肪組織和乳汁中，都能檢測到痕量的農藥或它們的代謝物。世界衛生組織根據農藥對人的急性毒性將農藥分成五類[2]。所分成的類別從“有急性毒性”到那些“正常使用時沒有急性毒性”的種類。一些農藥被歸類為持久性有機污染物(POP)，致癌、致畸或內分泌干擾物。現在分析食品和環境樣品中的農藥，跟蹤它們在環境中的分布以保證食品安全，是一項日常工作。

　　目前很多分析方法僅僅針對一部分可能存在的化合物。無論是食品還是環境樣品，由于其中一些天然產物能夠被一起提取出來，分析工作變得較為復雜。食品或組織提取物是非常復雜的樣品基質，在分析之前需要進行若干樣品凈化步驟[3]。即便如此，在殘余基質存在的情況下檢測痕量的污染物也很困難。

　　為了提高效率，必須采用多殘留方法(MRM)分析更多的農藥。通常這些方法都采用帶有元素選擇性檢測器的氣相色譜儀(GC)來確定不同基質中的農藥[4，5，6]。氣質聯用(GC/MS)已廣泛地用于命中峰的確證。液相色譜(LC)常用于分析那些不能采用GC分析的化合物[2]。現在，越來越多的農藥實驗室利用液質聯用(LC/MS)和氣質聯用(GC/MS)作為基本的分析工具[7，8]。許多多殘留方法(MRM)仍然是針對部分目標農藥而建立的方法。但采用這種多殘留方法，任何不在目標化合物列表中的農藥都可能會被漏掉。

　　本文采用保留時間鎖定(RTL)[9，10，11]和譜圖Deconvolution技術[12]，建立了一種能夠篩查567種農藥和可疑內分泌干擾物的簡單的GC/MS分析方法。譜圖Deconvolution能夠幫助識別農藥化合物，即使農藥被共流出的基質化合物所包埋，同樣也可以被識別。保留時間鎖定能夠消除假陽性，使結果更可靠。需要時，使用者很容易在該方法中加入新的化合物。

實驗部分

　　表1列出了安捷倫公司在農藥分析中采用的儀器、軟件和分析參數。根據進樣量的需要，可以采用PTV進樣或分流/不分流進樣。

樣品

　　蔬菜提取物由美國加州食品農業局(CDFA；Sacramento，CA USA)的Mark Lee和Stephen Siegel博士和新西蘭TNO營養和食品研究所( Zeist ， The Netherlands)的J.G.J.Mol博士提供。17個地表水的GC/MS分析數據文件也由CDFA提供，并在本實驗室采用DRS進行了處理。17個作物提取物的GC/MS數據文件(鎖定在安捷倫農藥分析方法中)由英國NRM實驗室(Berkshire，UK)提供。

結果與討論

保留時間鎖定(RTL)和RTL數據庫

　　保留時間鎖定(RTL)是由安捷倫公司開發的一種技術，采用這種技術使用者可以在世界上任何一個實驗室的任何一臺Agilent 6890 GC上使分析物的保留時間相匹配，前提是采用相同的常規GC方法和毛細管柱[13]。采用RTL技術，安捷倫公司開發了幾個用于GC和GC/MS的保留時間鎖定數據庫，包括每一次進樣的鎖定保留時間、化合物名稱、CAS號、分子式、分子量和質譜圖(只在GC/MS數據庫中提供)[14]。安捷倫RTL農藥庫包含了幾乎所有可用于GC分析的農藥和一些內分泌干擾物的信息，共567個化合物。要采用以下討論的DRS，這個信息庫需要轉換成NIST格式[15]。AMDIS所使用的包含有保留時間和化合物信息的譜庫是由原來的RTL農藥庫生成得來的。使用者可以很容易在這些庫中加入新的農藥或其它感興趣的化合物[15]。

Deconvolution的基本知識

　　在GC/MS中，Deconvolution是一種數學技術，它可以將重疊的質譜圖“分開”成為“清晰”的單個組分的譜圖。圖1是這個過程的簡單示意圖。這里分別是總離子流色譜圖(TIC)和質譜圖。與常見的情況一樣，這個色譜峰包含了多個重疊在一起的組分，而最高點質譜圖實際上也是這些組分的組合圖。質譜譜庫檢索只可能給出一個較差的匹配，而且不能識別所有構成這種組合譜圖的單個化合物組分。

Deconvolution過程是在尋找那些單個豐度在譜圖中上下一起波動的離子。它首先校正了四極桿質譜固有的譜圖偏斜，為每一個色譜峰得到了一個更準確的頂點保留時間。如圖1所示，Deconvolution為每個重疊的組分提供了“清晰”的譜圖。在用譜庫檢索時這些單個譜圖就可能得到良好匹配。

　　這種包括在安捷倫DRS軟件中的AMDIS軟件由國家科學技術研究所(NIST)提供[12]。

DRS

　　安捷倫公司的DRS是由三個不同的GC/MS軟件包組合而成的：1)安捷倫GC/MS化學工作站，2)帶有NIST‘02質譜譜庫的NIST質譜檢索程序，3)AMDIS軟件，也來自NIST。在DRS軟件中包含有567種農藥和可疑內分泌干擾物的質譜圖和鎖定保留時間信息庫。

　　DRS包括三個獨立但互補的數據分析步驟。首先，GC/MS化學工作站軟件采用一個目標離子和3個以上的定性離子對目標農藥進行常規的定量分析，并報告所檢測的校正化合物的含量。對于數據庫中的其它化合物，可以采用DRS軟件提供的平均農藥響應系數(RF)估算它們的含量值并報告結果。然后，DRS將數據文件發送到AMDIS軟件，進行譜圖的Deconvolute并采用Deconvoluted全譜圖在安捷倫鎖定保留時間RTL農藥庫中進行檢索(以AMDIS格式)。在AMDIS中可設置一個過濾器，要求分析物的保留時間必須落在由使用者規定的時間窗口。由于RTL是用來給出高精度的RTL數據庫保留時間的，這個窗口可以設得很小，通常為20秒或更短。最后，由AMDIS找到的所有目標化合物的Deconvoluted譜圖在147,000個化合物的MIST質譜譜庫中進行檢索確證。在這一步驟中，不需要保留時間。

　　一旦建立合適的方法，只需要簡單的點擊鼠標，DRS報告就可以生成，如圖2所示。這個軟件可以在每次分析完成時或在分析之后對一個單獨的文件或一批文件自動運行。

中草藥混合物中的農藥

　　圖3是一個中草藥混合物的提取液的總離子流色譜圖。圖4是該樣品的MSD Deconvolution報告，該報告是以HTML格式形成的，以便于通過電子郵件發送或拷貝到電子表格中。選擇這個樣品是因為草藥屬于最難分析的植物樣品。它們的提取液中含有大量的天然產物會影響農藥的分析。

　　圖4中的DRS報告列出了每個命中峰的保留時間、CAS序號和化合物名稱。報告下端列出的菲-d10是內標物(ISTD)，化學工作站利用它來估算所檢出的每個化合物的含量。由于所有的567種目標化合物都采用了一個平均農藥響應因子，因此第4列列出的含量值僅僅是估算值。實驗表明，報告中大多數采用平均農藥響應因子得到的含量估算值都落在它們真實值的10倍范圍內。準確的定量要求采用常規的農藥標準品進行校正，但對于數據庫中所有的農藥進行逐一校正是很難實現的。在實驗室通常可以對一部分目標農藥制備校正曲線，對數據庫中的其它化合物則采用它們的平均響應因子來進行計算。采用這種方法，當一種新的化合物被檢出，實驗室很快可以得到其含量的估算值并決定是否需要將它加入校正列表。

　　報告的第5列列出了利用AMDIS進行去卷積并采用Deconvoluted全譜圖在保留時間鎖定(RTL)農藥庫中進行檢索得到的匹配系數。在本例中，AMDIS比化學工作站軟件識別出了更多的目標化合物(如撲滅通和p,p-DDE)，這是一個典型的復雜樣品。當得到鎖定的保留時間后，在AMDIS軟件中可設置一個保留時間范圍是一個重要的優點。此時，那些落在數據庫保留時間RT±10s范圍之外的峰被去掉。第6列列出了化合物的信息庫RT值和它們在色譜圖上的真實保留時間值之間的差別(單位是秒)。

　　圖4說明除農藥以外，該軟件還識別了兩個鄰苯二甲酸酯類(可疑的內分泌干擾物)。鄰苯二甲酸酯類在環境中普遍存在，極難從背景中除去。在這種情況下，沒有采取措施去確定這些鄰苯二甲酸酯類是從樣品中提取出來的還是在實驗中引入的。

　　DRS報告中的最后兩列列出了所有的AMDIS峰在NIST 147,000個化合物質譜譜庫中進行檢索的結果。當NIST譜庫檢索發現一個化合物屬于匹配的前100個(可由使用者設定)，與AMDIS的結果一致，它的匹配系數就被列在第7列。命中峰的序號列在最后一列，在NIST中“1”表示是最好的匹配(匹配系數最高值)。有時NIST譜庫檢索找不到譜圖匹配前100名的AMDIS命中峰。這時，報告中的下一行列出了該譜圖的最佳譜庫匹配。氟胺氰菊酯(圖4)就是一個例子，該化合物在34.779 min流出。下一行列出了氟胺氰菊酯，它是那個譜圖的最佳NIST譜庫匹配。此時，在NIST質譜譜庫中沒有化合物與氟胺氰菊酯有相同的CAS序號。事實上，氟胺氰菊酯-tau-I是一個D型異構體，而氟胺氰菊酯是DL異構體混合物。

DRS和傳統數據處理進行盲樣的比較

　　比較表明，從復雜樣品例如食品和環境基質中識別目標化合物方面DRS比傳統方法優越得多。下面是兩個相關的研究。第一例情況，英國Berkshire的NRM實驗室采用安捷倫保留時間鎖定農藥方法分析了17個未添加農藥的作物樣品。將得到的數據文件(不是他們所列出的農藥命中峰)發送到安捷倫采用新的DRS進行分析。表2比較了兩個實驗室的分析結果。采用手動數據處理，NRM從17個樣品中檢出了28種農藥，其中4種低于它們的最低校正水平。采用同樣的數據文件，DRS檢出了33種農藥。

安捷倫的自動方法沒有識別春季洋蔥樣品中的嘧菌酯，因為它不包括在RTL農藥庫中。但是它能夠被NIST譜庫找到，它在403 amu處有分子離子，而NRM采用的方法只掃描到400 amu。DRS方法確證了所有四種低于NRM校正范圍的農藥，并找到了在它們的方法中沒有包括的另外五種化合物(特草定、嘧霉胺、甲硫威、噠螨靈和霜霉威)。

　　手動和自動方法的一致性很好。但是，DRS能找到更多的農藥，它能夠找到那些被手動方法漏掉的化合物。此外，采用手動數據處理分析17個樣品需要花費一個化學家大約7小，而DRS只需要計算機花50分鐘即可完成。

　　地表水樣品的分析：在另一個研究中，CDFA分析了17個地表水提取物中的農藥。圖5是兩個典型樣品的TIC總離子流色譜圖。CDFA采用保留時間鎖定(RTL)和RTL數據庫檢索，但沒有使用譜圖Deconvolution。同樣的數據文件采用DRS進行對比分析。

表3列出了對17個CDFA樣品的手動分析和DRS分析的對比結果。CDFA在17個樣品中檢出38種農藥命中峰，一些命中峰是在不同樣品中的相同農藥。一個熟練分析人員花費了大約8小時進行結果分析，包括去掉假陽性并確證所有的命中峰。DRS找到了CDFA檢出的37種化合物并識別了CDFA的一個假陽性的命中峰。此外，還檢出了另外34種農藥，17個樣品中一共識別了71個命中峰。這個過程完全自動化，僅僅是計算機花費了大約20分鐘時間處理所有的數據文件。

結論

　　安捷倫公司新的農藥分析DRS給實驗室帶來了一些真正的便利。
　　? 容易使用：該軟件使用十分簡單，不會比使用6890N/5973 inert GC/MS系統需要更多的技術。使用者不需要學習有關復雜的Deconvolution知識或掌握一個新的軟件包。
　　? 自動化：Deconvolution報告能夠在每運行一次后自動生成，也可以將一批樣品一起處理。
　　? 節約時間：數據處理的時間從幾小時縮短為幾分鐘。
　　? 質量：它給出的報告假陽性和假陰性最少。
　　? 重現性：分析結果不取決于操作者的技術或經驗。
　　? 準確度：本文討論中進行的比較說明DRS在識別農藥方面比手動數據分析具有更高的準確度。它對于相對復雜一些的樣品尤其適用，因為這些樣品的共提物基質組分可能會掩蓋痕量的目標農藥。
　　? 全面：該方法采用一次簡單的GC/MS運行即可篩查幾乎所有可采用GC分析的農藥和一些可疑的內分泌干擾物。該方法共包括567種化合物，是現有的最全面的農藥篩查工具。在需要時使用者還可以在方法中加入更多的化合物。
　　? 提供定量、半定量和定性結果：所有校正化合物都可以定量檢測。其它任何一種化合物的含量都可以采用由軟件提供的平均農藥響應因子進行估算。

　　DRS的使用并不僅僅局限于農藥分析中。其它目標化合物質譜譜庫也可以轉成AMDIS格式來使用這個軟件。例如，可以利用已有的毒物、香精香料、有機污染物等的譜庫。使用者甚至可以利用DRS建立自己的譜庫。雖然并不是必需要求，但對每一次進樣都建立一個包含有鎖定保留時間的RTL信息庫是很有好處的，因為這樣將給出最少的假陽性結果。

致謝

　　作者非常感謝加州食品和農業局的Mark Lee和Stephen Siegel博士、Netherlands TNO研究所的J.G.J.Mol博士和英國NRM實驗室的管理和工作人員，感謝他們提供了樣品和數據。