實驗中應該清楚試劑有效期，試劑的其它性質

最近做果蠅胚胎的原位雜交五六次了。原位雜交的基本流程是：探針合成及胚胎收集、固定，預雜交， 雜交，抗體（堿性磷酸酶標記的抗地高辛）孵育，顯色。上次（第五次）在顯色的那一步遇到問題。以往的四次，都只要一兩個小時顯色就充分了，而那一次，用時 近二十個小時。

 

開始認為可能是顯色前用的堿性磷酸酶緩沖液有問題。在抗體孵育后、顯色前，標本需要用 PBS清洗三次去除未結合的抗體，再用堿性磷酸酶緩沖液洗三次，為堿性磷酸酶提供一個適合的離子環境和PH值。為了抑制RNA酶，我在許多緩沖液例如 PBS中都加入了EDTA，但是，是在做了第一次原位雜交之后才加入的。緩沖液保存于500毫升的玻璃瓶，用的時候，先轉移50毫升到大的塑料離心管中。 也就是說，第一管50毫升的堿性磷酸酶緩沖液是肯定沒加EDTA的，而后面的可能加了。前面幾次用的是第一管，上一次用的從500毫升的瓶子里面重新轉移 到大離心管中的。但是，當我檢查裝堿性磷酸酶的瓶子的時候，發現上面并沒有注明加了EDTA。由于我有時候會忘記做標記，我還是認為，可能是加了EDTA 但是沒有標記。而EDTA可以抑制堿性磷酸酶的活性的。

 

于是做第六次原位雜交。這一次，我重新配了堿性磷酸酶緩沖液，可以肯定是沒加EDTA 的了。顯色的時候，我只用了一半的標本，但是，顯色半個小時候，顏色基本上沒有變化！按照這種趨勢，肯定又要十幾個小時顯色才充分，顯然，問題不是上次用 的緩沖液加了EDTA，而是另有原因。

 

由于我這次用的探針稀釋濃度非常之高（1:1000），而且用了非常嚴格的洗脫條件， 所以也有可能是探針完全被洗脫了。但是，還有其它的可能嗎？

 

我忽然想到抗體失效的問題。于是去檢查了抗體的稀釋日期。由于抗體的使用濃度是 1:2000，所以我先配了一個1:20的稀釋溶液，否則加樣太少，無法實現。這個稀釋日期是5.21，而前四次都是在6.2之前做的，距離稀釋日期少于 等于12天，顯色沒有問題，第五次，是在6.12做的，距離稀釋日期已經有22天，今天距離稀釋日期已有29天。

 

同時我想到了導師曾經跟我說過，抗體稀釋后的保質期在一周左右。因為以前做免疫染色的 時候，有些抗體稀釋了一個月之后仍然有效，我當時并沒有太在意這個問題，而今想起來，確實非常可能是稀釋的抗體失效了。

 

于是設計了一個簡單的實驗來檢驗這個推測。重新做了一個稀釋的抗體，加了顯色液于解剖 板的三個孔中，然后，第一個孔加入1微升5.21稀釋的抗體，第二個加入一微升新稀釋的抗體，第三個孔為空白對照，不加抗體。三分鐘后，顏色變化非常明 顯：第二個孔明顯比第一個孔顏色要深，而第三個孔基本上不變色。

 

幸好，我只用了一半的標本顯色，還留有一半標本。這樣，我就不用從頭開始，節約了兩天 時間。于是就把另外一半標本重新用今天稀釋的抗體孵育，然后再顯色。兩個小時后，顏色變化就已經很明顯了。

 

 

首先，一定要非常清楚試劑的保質期。實驗失 敗，試劑過期是一個常見原因。如果不清楚試劑保質期有多久，就可能用過期的試劑，導致實驗失敗，浪費時間。不同的試劑保質期是不一樣的，酶、抗體等蛋白質 制品保質期較短，而且稀釋后有效期維持更短。很多實驗室，為了節約經費，往往會用已經過了保質期的試劑。很多情況下，這些試劑雖然過期，但是還是有效的。如 果實驗室有人最近用過而且有效，則可以放心使用。但是，如果不清楚這些試劑是否有效，則使用之前需要設計一個簡單的實驗來檢測。

 

其次，實驗用品一定要做好詳細的標記，包括： 名稱（全稱或通用的簡稱）、配置日期，配置者姓名、PH值、配好后是否又加入了某些試劑等等。標有日期，將來才清楚是否過了有效期。這一次，前面我對顯色 失敗的原因分析之所以不對，就是因為我沒有嚴格地做到這一點，所以，即使沒有標明加了EDTA，我也不能排除已經加過。

 

實驗室里常常有前人留下的配好的試劑。對于這些試劑，使用的時候一定要清楚可能失效 了。一般來說，沒有標明配制日期而且試劑本身有效期較短且試劑不貴的情況下，應該拋棄。很多試劑，最好是使用自己親自配制的，否則實驗中出了問題難以找出 原因。

 

推而廣之，除了應該清楚試劑的有效期之外，還應該清楚試劑的其它性 質。例如，是否有毒？使用的過程中應該注意些什么？如果不清楚哪些試劑有毒、操作中怎樣保護自己，就容易使自己受到有毒物質的侵害。除 了毒性之外，還必須清楚試劑的其它注意事項，例如作用的基本原理、配制過程中需要注意哪些問題等等。

 

此外，對于每一次失敗，每一個實驗中遇到的問題，應該提出至少三 種可能的原因。我之所以第一次分析原因的時候沒有找到正確的原因，還在于我只提出了一個可能的原因。事實上，引起問題的可能性是多種多 樣的，只提出一個解釋，對的幾率較小，如果同時提出多個假設，其中有一個正確的可能性就會大大增加。一開始就提出多個可能，可以在做實驗檢驗的時候同時檢 測多個因素，這樣，就容易通過一次實驗找到癥結。如果一開始提出一個可能，做實驗去檢驗，發現不對，又提出另外一個可能，再做一次實驗，發現還是不對，然 后提出第三種可能，做第三次實驗才發現原因，效率就會大大降低。