蛋白質修飾的組學研究與藥物發現

糖基化修飾

　　蛋白質糖基化修飾的研究是翻譯后修飾的主要內容之一。有關研究表明，在全部表達的蛋白質中，約50%的蛋白質為糖蛋白，在已發現的蛋白質抗體，實質上相當部分是針對糖鏈抗原（有統計占全部抗體的70%以上）。蛋白質糖基化主要研究，組織細胞的糖蛋白的全部表達，蛋白質的氨基酸順序、聚糖的單糖組成及連接鍵、糖基化位點、修飾方法和蛋白質糖鏈的結構鑒定，建立糖蛋白質的數據庫及其與生理和病理過程的關系。在糖蛋白質組學研究中，新技術新方法的建立和發展具有決定性作用，與人類相關生理和病理相關聯、較為獨立且完整的研究成果，尚迫切需要方法學和新技術上的系列突破。

　　目前全世界與糖相關的文獻，已經從90年10000篇穩定地增長到目前平均每年60000篇，發展勢頭十分強勁。在糖蛋白質組學研究上，日本已經較為領先，形成的戰略包含：蛋白質組學戰略（Proteomic strategy,高通量的蛋白質分析）、糖組學戰略（glycome strategy, 糖蛋白基因的確定和每一糖基化位點的聚糖圖譜）和糖形成戰略（glycoform. strategy, 發展聚糖解析的自動化方法）。日本的“糖工程前沿計劃”在1991年就啟動，但是重點在于單個糖蛋白糖鏈結構分析及功能的研究。2001年4月起動了人體細胞糖鏈的研究，發現合成糖鏈的酶基因和糖鏈功能的解析；近來又能提出“糖鏈功能1000”的前沿計劃，包括糖信息學、糖生物學和糖工程研究組成的糖系統生物學，目標是闡明糖鏈的功能，設計“糖藥物”用于治療心血管疾病、癌癥、炎癥和感染性疾病。國際上肝臟糖基化修飾譜的研究未見實質性啟動和報道。美國于1986年創建了復合糖研究中心，2000年建立了50000個糖蛋白的數據庫，啟動了“線蟲糖組學”研究，2001年設立了“功能糖組學”研究項目，目的是闡明蛋白質-糖鏈的相互作用和連接到的細胞信息機制。美國亦在研究糖鏈微陣列技術（糖芯片），但是還未真正的在人類組織蛋白質組學中應用。

　　國內的糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖的研究已經有多年的歷史。大部分集中在功能的研究，單一糖蛋白的結構和功能研究較多，糖基轉移酶的改變和疾病的關系。國內在糖蛋白糖鏈的大規模，高通量分析方法正在啟動，需要繼續努力，才能常規應用。

　　在糖蛋白質組學與疾病的關系，已經從基礎研究的角度研究疾病時細胞和蛋白的聚糖的變化規律、聚糖結構對蛋白功能的研究，內容涉及腫瘤、代謝性疾病、心腦血管疾病、先天性遺傳病等等。

　　糖蛋白糖鏈結構與功能的研究是當前蛋白質組學發展后的重要延伸領域。由于糖鏈結構分析的復雜性和樣品較難處理，結構分析費時，效率低。初步建立高通量、高效率、低成本的研究蛋白質糖基化修飾的共性平臺技術，從宏觀上了解糖蛋白糖基化修飾的規律，從中尋找有重要生物功能的蛋白質，也是目前國內外糖蛋白研究的趨勢。目前國際上對糖蛋白和聚糖的研究大都集中于糖蛋白結構的方法學的研究，在此領域有很大的舞臺。

磷酸化修飾

　　蛋白質的磷酸化是僅次與糖基化最普遍最重要也是研究最多的后修飾蛋白質，在哺乳動物細胞蛋白質組中占有約1/3數量比例，蛋白質磷酸化的可逆性在細胞內外各類信號傳遞、細胞生長、分裂分化、代謝和疾病發生等過程發揮著極其關鍵的作用。調控蛋白質或酶在特定位點上被蛋白激酶磷酸化后，蛋白質酶會被激活、被抑制或被標記作為其它調節因子靶標。磷酸化的位點主要集中在3個氨基酸位點，90%磷酸化發生在絲氨酸上，9.9%發生在蘇氨酸位點上，僅0.1%發生在酪氨酸殘基上。信號轉導中酪氨酸的磷酸化比例往往增加更多并受到更強的調控。磷酸化對于蛋白質而言是非均一性的，大多數磷酸化蛋白質都有多個磷酸化位點，但這并不意味著某一蛋白質分子的所有潛在的磷酸化位點都是磷酸化的。人類的基因組中有2%的序列來編碼磷酸化蛋白質，主要是蛋白質激酶和磷酸酯酶，其中絲氨酸和蘇氨酸的數量是酪氨酸激酶的4倍，而它們的磷酸酯酶數量基本相同。

　　磷酸化是所發現的最重要的蛋白修飾，癌癥的發生及發展已經被證明與信號通路中蛋白的磷酸化修飾改變密切相關，系統研究癌變過程中蛋白磷酸化修飾的改變有可能獲取最豐富的特異蛋白修飾信息；此外，固化金屬配體親和層析技術（IMAC）的出現也為系統研究磷酸化修飾提供了高通量的技術手段。

乙酰化修飾

　　蛋白質的乙酰化是細胞內蛋白質翻譯后修飾的一種重要形式。乙酰化蛋白是蛋白質修飾及其生物學意義的另一新興領域。蛋白乙酰化發生于蛋白中賴氨酸殘基的?-NH2位。賴氨酸乙酰化可以發生于多種蛋白靶分子。乙酰化修飾使蛋白“獲得功能”或“喪失功能”，乙酰化和去乙酰化是蛋白活性調節的一種重要形式，它可以調節基因轉錄的活性、改變蛋白-蛋白相互作用，導致與發育、增殖相關的疾病。因此，乙酰化蛋白組研究已經成為基因表達、蛋白組學、酶動力學研究中的一個重要內容之一，同時還影響蛋白的磷酸化、泛素化修飾等。

　　乙酰化是一種重要的蛋白翻譯后修飾，乙酰化修飾的蛋白在核內參與基因轉錄調控并直接影響許多重要的抑癌基因的功能，比如p53蛋白。蛋白乙酰化修飾在核外蛋白的研究較少見報道。但是，最近科學家關于乙酰化直接影響核外蛋白功能的發現可能為核外蛋白乙酰化的研究打開了新的大門，尤其是最近對蛋白質乙酰化的初步蛋白組研究向我們展示了乙酰化在細胞功能調控的廣泛存在，提示開展對癌癥蛋白乙酰化修飾譜的研究有可能讓我們獲得大量的原創性的研究成果，同時，高親和力和高特異性的抗乙酰基賴氨酸抗體的出現為系統研究癌蛋白乙酰化提供了必要的技術保障。

　　乙酰化蛋白結構與功能的研究是當前蛋白質組學發展后的重要延伸領域。以往的研究主要集中于個別獨立蛋白群，分析費時，效率低。目前為止，國際上乙酰化修飾的大規模、高通量分析方法的研究未見實質性啟動和報道。只有極少數的高通量研究乙酰化蛋白質分離鑒定的報道，研究尚未深入，并且還未真正在蛋白質科學中得到應用。因此，建立高通量、高效率、低成本的研究蛋白質乙酰化修飾的共性平臺技術，從宏觀上了解蛋白乙酰化修飾的規律，從中尋找有重要生物功能的蛋白質，是目前國內外蛋白質修飾研究的趨勢。

泛素化修飾

　　蛋白質的泛素化始于上世紀七十年代，1975年首次報道了有關泛素與蛋白質降解之間的聯系，證明細胞中存在一種76個氨基酸的豐度蛋白與依賴蛋白酶的酶切反應有關，前者被稱為泛素（ubiquittin）。隨后的研究鑒定了一系列的酶，它們將泛素間個地或連續地附著到將被降解的蛋白質賴氨酸殘基上，這一過程稱為蛋白質泛素化（ubiquitnation）。泛素普遍存在于人體內的細胞中。1980年發現泛素的基本功能的三位科學家獲得了04年的諾貝爾化學獎。在隨后的研究過程中，人們發現真核細胞中泛素化修飾后的靶蛋白可能被降解，可能被轉移到細胞或細胞外的特定部分，也有可能導致靶蛋白的功能發生變化，這主要取決于靶蛋白所加的泛素鏈的結構以及泛素鏈的長短。因此，蛋白質的泛素化并不一定是一個死亡信號。提出了用蛋白質翻譯后的泛素化修飾來描述泛素連接到靶蛋白這一現象。由于泛素所扮演的重要作用，它已經在一定的程度上決定了生命關鍵過程。

　　因此，泛素化是被廣泛研究的蛋白修飾之一，其與癌癥發生發展的關系也已經得到證實。但是，由于泛素家族成員的多樣性，尚有很多泛素家族成員對蛋白修飾以及與癌癥發生發展的關系都有待證實與發現，系統開展癌癥相關蛋白各類泛素化修飾的研究不但可以闡明各種蛋白泛素修飾在癌癥發生中的作用，更可以獲得大量的泛素修飾酶的相關信息，為尋找新的藥靶蛋白提供科學依據。

亞硝基化修飾

　　蛋白質亞硝基化修飾可通過影響蛋白質活動，蛋白質表達，亞細胞定位，分子間相互作用對蛋白質功能進行調控。一氧化氮（NO）通過 cGMP 路徑的方式來調控許多重要生理功能的研究至今相當成熟。然而，越來越多的的報告顯示，NO可以不經由cGMP 路徑的方式來執行功能；其中最受到矚目的是對蛋白的半胱胺酸（cysteine）上進行翻譯后修飾，即半胱胺酸亞硝基化作用（S-nitrosylation）來調控，1994年Stamler首先提出了蛋白質亞硝基化的概念。即：一氧化氮作用蛋白質半胱氨酸巰基-SH生成-SNO，并指出一氧化氮通過蛋白質巰基亞硝基化修飾進行氧化還原信號轉導調控，像磷酸化一樣，亞硝基化有明確靶標，和時間空間精確調控的。一氧化氮是生物信使分子，同時也是代謝信息分子和生物效應分子，人們對一氧化氮進行了廣泛的研究，逐步發現，一氧化氮作為一種信號傳導分子，它的升高是由一氧化氮合酶的表達水平調控的人體組織中有三種一氧化氮合酶：神經型一氧化氮合酶、內皮型一氧化氮合酶和誘導型一氧化氮合酶，它們分別分布于神經元細胞、血管內皮細胞和巨噬細胞中。

　　研究表明：蛋白質亞硝基化產物在多種疾病中表現異常升高和降低。與亞硝基化修飾的蛋白質組修飾譜研究還沒有開展，與疾病相關的關鍵亞硝基修飾蛋白質分子及其作用機制與通路尚有待發現。因此，建立具有國際先進水平的高通量、高靈敏度、高準確性、高穩定性的蛋白質亞硝基化檢測技術平臺非常緊迫。以便為揭示這些疾病的發病機理和防治提供新的思路，并為人類健康開辟新的道路。隨著人們對蛋白質亞硝基化研究的不斷深入，需要從蛋白質組學角度對其進行系統研究，以反映蛋白質亞硝基化修飾對細胞功能調控的全貌。

　　正是由于對蛋白翻譯后修飾重要性的重新定位，導致了疾病相關的蛋白修飾蛋白組學研究的迅速崛起，可以預期在未來的3-5年時間內國際上將會產生大量的疾病相關的蛋白修飾譜蛋白組研究成果，并最終導致大量新的疾病標志物和疾病特異藥靶蛋白的發現。以蛋白的乙酰化為例，自20多年前發現蛋白的乙酰化修飾以來，對蛋白乙酰化功能的認識幾乎一直局限在乙酰化對于轉錄的調控，但是，初步的細胞蛋白乙酰化研究表明：細胞內有大量的蛋白能夠被乙酰化修飾，尤其是在線粒體內. 乙酰化如此廣泛的存在提示其重要的生理功能，也為尋找新的疾病治療手段開辟了新的領域。此外值得重視的是，近年來在臨床癌癥治療中取得突出效果的特異抗癌藥物Gleevec正是基于調節蛋白翻譯后修飾（抑制蛋白磷酸激酶活性）的抗癌新藥，Gleevec的成功不但驗證了對蛋白翻譯后修飾進行重點深入研究的必要性，更可以預見未來國際醫藥產業在蛋白翻譯后修飾領域的競爭將日趨激烈。
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