應用親和磷酸蛋白質組學篩選氧化應激重塑型LPS通路的侯選信號分子

[摘　要] 　目的: 研究低劑量LPS刺激的Thp - 1細胞在有或無H2O2 預處理時磷酸化蛋白組的差異,以初步篩選氧化應激重塑型LPS通路中的新信號分子。方法: 使用PMA刺激Thp - 1單核細胞36 h使之分化成為成熟的巨噬細胞,靜息36 h后,先以等體積的培養基或100μmol/L H2O2 刺激1 h,再以培養基或10μg/L LPS刺激30 min。采用PMAC ( phosphop rotein metal affinity column)富集各組細胞的磷酸化蛋白質,經超濾除鹽后進行二維凝膠電泳,比較LPS組和H2O2 +LPS組的磷酸化蛋白圖譜的差異,并挑選部分斑點進行質譜鑒定。結果: 相對于LPS組(僅用LPS刺激的細胞) ,在H2O2 +LPS組(LPS刺激前經H2O2 提前處理的細胞)中,有29個磷酸化蛋白斑點在雙向電泳圖譜中表現出可重復的差異,其中, 17個斑點發生了上調(包括新出現的斑點) , 12個發生了下調(包括消失的斑點) 。我們已經鑒定出其中5個差異蛋白,這些蛋白參與多種多樣的細胞過程例如蛋白質降解、信號轉導和蛋白質折疊等。其中,在H2O2 +LPS組中顯著下調的p roteasome beta - 4亞基與LPS信號傳遞關系密切。結論: 親和磷酸蛋白組學有效減少了高豐度的結構蛋白的干擾并增加了信號分子檢出的可能性。上述5個蛋白尤其是p roteasome beta - 4亞基可能是氧化應激重塑型LPS通路的重要調節分子。