HPLC測定馬鞭草中熊果酸的含量

摘要：目的：建立重現性好，靈敏度高并且比較穩定的高效液相色譜法測定馬鞭草中熊果酸含量，并進行方法學考察。方法：Hypersil ODS色譜柱(4.0 mm×250 into，5 pm)；柱溫35℃；流動相為乙腈一0.1％ 磷酸水溶液(75：25)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為210 nm。結果：熊果酸進樣量在0.624～3.120μg呈良好線性關系，平均回收率97.02％ ，RSD為0.94％(n=5)；結論：本法準確、靈敏度高、重現性好，更適用于馬鞭草藥材質量控制。

關鍵詞：馬鞭草  熊果酸  高效液相色譜法

    1、 儀器、樣品、試劑
    AGILENT 1 100高效液相色譜儀；
    馬鞭草藥材購于貴陽市，經貴陽中醫學院陳德媛研究員鑒定為馬鞭草科植物馬鞭草Verbena officina lis L．；熊果酸對照品(742—200111，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所)；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

    2 、方法與結果
    2．1 色譜分析條件
    Hypersil ODS(5 m，4.0 mm×250 mm，Agilent)色譜柱，乙腈-0.1％ 磷酸溶液(75：25)為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫35℃ ，檢測波長210 nm；理論板數以熊果酸峰計算不低于4000；分離度大于1.5。
    2．2 樣品測定方法
    2．2．1 對照品溶液的制備
    精密稱取熊果酸對照品適量，用甲醇溶解，制成每1 mL中含0.208 mg的對照品溶液。
    2．2．2 供試液的制備精密
    稱取本品粉末(過40目篩)1 g，精密加入30 mL氯仿，密塞，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用氯仿補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，回收氯仿至干，殘渣用石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次10mL(浸泡約2 min)，傾去石油醚液，殘渣加適量甲醇使溶解，轉移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用l0.45μ m微孔濾膜濾過，即得。
    2．2．3 測定方法
    分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5μ L，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算，即得。
    2．3 方法學考察
    2．3．1 線性關系考察
    精密稱取熊果酸對照品適量，用甲醇溶解，制成每1 mL中含0.208 mg的對照品溶液，精密吸取對照品溶液3，5，7，9，11，13，15μ L依次進樣，記錄色譜圖。以熊果酸的進樣量(μ g)為橫標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y=452.418127X一1.1600976 r=0.9999(l=7)，結果表明熊果酸進樣量在0.624～3.120 μ g范圍線性關系良好。
    2．3．2 穩定性試驗
    精密吸取供試液5μL，定時進樣測定，時間間隔為0，2，4，6，8h測定結果依次為 3.9348，3.9439，3.9504，3.9586，3.9642 mg /g ，供試品中熊果酸含量平均值為3.9504 mg/g，RSD=0.29％ ，結果表明試驗方法穩定，供試液至少在8 h內測定較穩定。
    2．3．3 精密度試驗
    精密吸取供試液5μL，連續進樣5次，測定結果依次為3.9088，3.9099，3.9021，3.9177，3.9064 mg/g，測得熊果酸含量平均結果為3.9090 mg/g，RSD=0.15％ ，表明精密度良好。
    2．3．4 重復性試驗
    取同一批馬鞭草粉末(過40目篩，按干燥品計)5份，各約1 g，精密稱定，按上述方法制備供試液，測定。5份樣品熊果酸平均值為3.9448 mg/g，RSD=0.71％ ，表明方法重復性良好。
    2．3．5 加樣回收試驗
    取馬鞭草粉末(過40目篩，按干燥品計)5份，各約0.5 g，精密稱定，于每份中加入1.860 mg對照品，按含量測定項制備供試液，進樣，記錄色譜圖，計算熊果酸回收率，平均回收率為97.14％ ，RSD=0.94％ ，表明回收良好。
    2．3．6 樣品測定結果
    按上述方法和色譜條件對不同產地馬鞭草藥材進行熊果酸的含量測定，同時采用薄層掃描法測定，測定結果顯示，HPLC法的誤差明顯低于TLCS法。分別測定了馬鞭草葉、莖中熊果酸的含量。

3 、討論
    3．1 提取條件的選擇
    熊果酸為非極性的五環三萜酸，選擇甲醇、乙醇、氯仿作為提取溶劑，比較了3種提取溶劑和不同提取時間，結果甲醇、氯仿對熊果酸的提取率基本一致，均高于乙醇。由于氯仿提取物中極性較大的雜質少，測定時干擾小，故選用氯仿為提取溶劑，超聲提取1.0 h，較為適宜。
    3．2分離條件的選擇
    根據查閱文獻資料，對熊果酸的分離多選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；故本文選擇了3種色譜柱：(1)Hypersil ODS(5 m，4.0 mm×250 mm，Agilent)色譜柱，(2)HypersilODS2(5 am，5 mm×200 mm，大連依利特)色譜柱，(3)Diam0nsi (鉆石)HPLC C18(5 m，4.6 mm×250 mln，迪馬公司)色譜柱；及4個流動相：(1)甲醇．水(88：12)；(2)甲醇-0.1％ 磷酸溶液(80：20)；(3)乙腈一水(80：20)；(4)乙腈-0.1％磷酸溶液(75：25)進行系統適用性試驗。
試驗結果表明：在 色譜條件：Hypersil ODS(5 m，4.0 lmTl×250mm，Agilent)色譜柱，乙腈-0.1％磷酸溶液(75：25)為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫35℃ ，檢測波長210 nm，供試品中熊果酸得到較好分離，理論板數達到6000，分離R=2.20。
    3．3 檢測波長的確定
    熊果酸于190～400 nm波長下掃描，最大吸收波長為195 nm，為紫外末端吸收。在210 nm波長處熊果酸吸收峰靈敏度較高，其他色譜峰干擾較小，熊果酸色譜峰的分離最為理想，故選用(210±1)nm作為檢測波長。