利用iTRAQ研究光控細菌代謝用于腫瘤治療

上一篇 / 下一篇 2018-06-25 16:56:45/ 個人分類：蛋白質組

題目：

Optically-controlled bacterial metabolite for cancer therapy. Nature Communications IF 12.124 iTRAQ

研究背景

　　隨著對共生微生物認識的日益加深，人們逐漸意識到腫瘤內部是細菌和細胞共生的復雜微環境，并且相當一部分的細菌可以特異性地從循環系統中富集到腫瘤部位。在先前的研究中，科研人員也發現這些共生細菌在腫瘤的發展過程中起到關鍵性作用。在人為改造下，這一類共生細菌能夠富集到腫瘤部位，抑制腫瘤生長，從而為腫瘤治療提供全新方案。

　　近來，許多納米級光催化材料如CdS和C3N4因其光電轉換能力引起了廣泛的關注，其可以將光能不斷轉換成電能。這些材料不僅能夠增加細菌的代謝活性，而且能夠避開負載極限，實現抗癌藥物的富產。受上述光誘導還原的啟發，本文作者將光催化系統與腫瘤靶向細菌融合，從而獲得用于光控制的一氧化氮（NO）生成的生物/非生物混合物。首先合成了抑制自由基生成能力的碳量子點摻雜的碳化氮（CCN），以實現原位光電轉換。然后，通過靜電相互作用組裝CCN和大腸桿菌（E. coli）以獲得CCN@E. coli。本文中，作者提出了一個利用修飾的CCN@E. coli的光控細菌代謝物療法（PMT）的概念。該技術利用修飾的CCN@E. coli將NO3-轉化為在光照下具有癌癥治療效果的抗腫瘤一氧化氮（NO）。作者還利用iTRAQ定量蛋白質組學技術來研究其詳細機制。PMT療法優化了生物/非生物混合系統在生物醫學中應用，轉變了細菌癌癥治療方式。

研究內容及結果

1. PMT系統的特性和機理

　　CCN@E. coli的制備如圖1a所示。CCN通過靜電相互作用與E. coli組裝到一起。TEM圖像顯示修飾后，CCNs位于E. coli表面，在此過程中E. coli的形態沒有發生變化（圖1c）。如圖1d所示，CCN和E. coli之間的空間重疊系數（0.94）也表明CCN@E. coli組裝成功。作者推測，由于其合適的帶隙，從CCN激發的光電子能夠通過電子載體（例如NADH）轉移至大腸桿菌的NO合成酶中。隨后，NO3-可能以NADH依賴性方式酶促還原為NO（圖1g）。因此作者利用經典的Griess方法研究了CCN@E. coli光學控制的NO釋放行為（圖2a）。

　　在正常生理條件下，L-精氨酸通過一氧化氮合成酶陽性細胞如巨噬細胞轉化為NO。然而，由于來源有限，并且NO可能最終被氧化成無毒的NO3-，所以生理條件下產生的NO的抗癌潛能力很微弱。在CCN@E.coli輔助下的PMT療法可將不可逆的腫瘤內NO代謝轉化為循環反應，最大限度地提高NO的生物利用度。PMT系統的機制是一個兩步過程：首先，E.coli利用發光的CCN光電產生的電子進行內源性NO3 -還原和NO生成(圖2g)，然后，由產生的NO引發細胞凋亡。

2. PMT的體外抗癌研究

　　為了使癌細胞和細菌在不直接接觸的情況下實現代謝物的交換，作者使用3D打印技術制作了一種共培養裝置。在這種培養體系中，NO可以通過CCN@E. coli（裝置外培養）的多孔膜擴散到癌細胞（裝置內培養），而CCN@E. coli或癌細胞都不能通過這個膜遷移。然后利用二氨基熒光素-FM二乙酸酯（DAF-FM DA）測定細胞內NO的濃度。如圖2i所示，4T1細胞中綠色熒光的增加表明，PMT系統產生的NO能有效擴散到附近的腔室，上調癌細胞中的NO的水平。沒有光照射的野生型大腸桿菌和CCN@E. coli不能使細胞內NO濃度增加（圖2j）。

　　如圖2k所示，使用CCN@E. coli光輻射的細胞存活率顯著降低，在CCN@E. coli光輻射量為108 CFU/mL時，高達70%的4T1細胞能在24小時內被殺死。此外，作者還發現血紅蛋白（一種NO清除劑）和Ac-DEVD-CHO（一種凋亡抑制劑）能有效地阻礙4T1細胞的凋亡（圖2I）。基于上述觀察，作者推斷NO誘導的細胞凋亡是4T1細胞死亡的主要原因。

3. PMT系統的體內生物分布研究

　　為評估PMT系統的腫瘤靶向能力，將DIR標記的CCN@E.coli靜脈注射到4T1荷瘤小鼠。如圖3a所示，隨著時間的延長，在腫瘤位置內檢測到熒光的也逐漸增強。如圖3b所示，離體熒光成像顯示大量的細菌積聚在腫瘤位置，而肝臟或腎臟滯留的細菌幾乎可忽略不計。值得注意的是，CCN的修飾并不影響E.coli的腫瘤靶向能力（圖3c）。

　　通常，大多數合成藥物載體由于其擴散限制，幾乎不能穿透腫瘤組織。而作者推測PMT系統可能能夠到達移植瘤的較深區域。結果表明，不同深度的腫瘤組織切片顯示PMT系統分布于腫瘤組織中（圖3d），并且發現移植瘤的中心聚積的細菌更多。為了全面揭示CCN@E.coli的腫瘤穿透性特征。作者使用表面活性劑輔助組織清除技術，即CLARITY，將腫瘤組織轉化為透明的形式（圖3e）。然后使用與腫瘤缺氧高度相關的生物標志物碳酸酐酶-Ⅸ（CA-9）對腫瘤缺氧區進行染色。從3D腫瘤熒光圖像可觀察到來自CCN@E.coli的紅色熒光和來自CA-9的綠色熒光的共定位，而CCN@E.coli熒光可以在含氧量正常的區域發現（圖3f）。進而證明了PMT系統可以充分利用大腸桿菌缺氧介導的趨化性，并且達到其他常規載體無法高效利用的缺氧區域。

隨后，作者研究了CCN@E.coli在主要代謝器官如肝、脾和腎中的清除動力學。通過PCR和定性免疫熒光染色證明大部分細菌可以隨著的時間延長而被清除。3周后，在免疫活性小鼠中可以檢測到極少量的細菌（圖3h），血液生化和血液學分析未發現PMT的長期副作用（圖3i）。

4. PMT系統中體內NO的生成

　　為了進一步闡明細胞光合行為，作者設計并構建了Nrf2受控螢光素酶表達質粒用以探測體內NO的產生，之后轉染4T1細胞以構建4T1Nrf2細胞用于原位NO的檢測。如圖4a所示，4T1Nrf2-luc細胞暴露在CCN@E.coli環境下會導致其生物發光快速增加，作者還研究了4T1Nrf2-luc腫瘤小鼠中PMT系統的體內效率。如圖4b所示，單獨的CCN和E.coli都不能誘導產生可檢測的NO。而CCN@E.coli處理組的生物發光強度顯著增加。接下來，作者還合成了用于NO檢測的磁共振成像（MRI）探針Fe-MGD。如圖4c所示，作者發現在注射了CCN@E.coli和光照后，小鼠腫瘤內的T1信號增強，進一步證明了體內光控制的NO生成。

5. PMT的體內抗癌機制

　　作者利用綴合有Cy5.5的膜聯蛋白V29來研究PMT的體內治療反應。如圖4d所示，隨著CCN@E.coli注射劑量的增加，CCN@E.coli在腫瘤部位的累積增多。圖4e的半定量分析結果也證明了腫瘤內細菌數目、腫瘤細胞毒性和NO濃度呈正相關。

　　此外，作者在4T1荷瘤小鼠和CT26荷瘤小鼠中檢查了PMT的抗癌效率，治療時間表如圖4f所示。在4T1荷瘤小鼠中，PMT治療抑制了79.3％的腫瘤生長（圖4g）。而在CT26荷瘤小鼠中，PMT治療抑制了70.2％的腫瘤生長（圖4h）。這些結果表明PMT應該能夠適用于治療不同類型的癌癥。

　　隨后，作者利用定量蛋白質組學技術探索了PMT的詳細抗癌機制。利用iTRAQ技術從4T1荷瘤小鼠癌組織（PMT處理組和PBS對照組）中共鑒定到4735個蛋白。如圖5a所示，在PMT治療后，腫瘤組織內鑒定到222個上調的差異蛋白和17個下調的差異蛋白（倍數變化≥1.5和P <0.05，超幾何檢驗）。聚類分析和主成分分析結果顯示PBS處理組和PMT處理組之間存在顯著差異。對差異蛋白進行GO分析發現，刺激應答、信號、細胞死亡、免疫系統和細胞殺傷相關的蛋白質在PMT組中顯著上調（圖5b）。相反，與細胞增殖和生長相關的蛋白更多地發生下調。這些數據表明PMT在腫瘤中引起高應激反應，這主要是由于NO誘導的氧化損傷，并且與抗氧化活性相關的蛋白質也顯著降低。通常，NO對癌細胞的細胞毒性主要歸因于其誘導氧化應激和引發DNA損傷的能力。圖5c所示的維恩圖表明，大腸桿菌感染/侵入相關蛋白與DNA損傷/氧化應激相關蛋白之間沒有重疊。因此，蛋白質組學研究表明CCN@E.coli對癌細胞的直接細胞毒性主要歸因于NO本身。

　　有趣的是，在GO分析中發現了參與免疫應答的蛋白質水平顯著升高。這一現象表明免疫系統可能有助于體內PMT的抗癌作用。PMT治療后蛋白相互作用網絡分析也可得出同樣的結論。如圖5e所示，KEGG分析發現抗原遞呈途徑被全面激活，并且證實了HMGB蛋白（一種參與觸發抗原呈遞的主導蛋白導致免疫原性細胞死亡）的上調。這些發現揭示了PMT可能通過HMGB引發MHC I類介導的途徑誘導免疫原性細胞死亡。在體外模擬環境中，發現PMT治療能夠誘導DC突變（圖5f）。這些結果表明，除了直接產生細胞毒性NO外，免疫應答也可能在在PMT的抗癌機制中起關鍵作用。

文章小結

　　一氧化氮（NO）在濃度較高的環境可以引發腫瘤細胞凋亡。為了實現對細菌合成NO能力的提升及控制，作者將碳量子點摻雜的碳化氮（CCN）負載到大腸桿菌(E.coli)MG1655上，利用合成材料良好的光催化性能，從而提高NO的產生，這一方法可以很好地實現細菌在腫瘤富集。本文作者全面研究了光控細菌代謝療法（PMT）中NO的生成，細胞毒性細胞殺傷作用及其相關機制。動物實驗證明，該療法在小鼠腫瘤模型上表現出了約80%的抑瘤率。這一發現對哺乳動物-微生物的共生關系有了更深認識，并且極大豐富現有腫瘤療法的內涵。定量蛋白質組學結果也表明免疫反應可能與該療法相關， PMT療法可能對癌癥免疫療法具有促進作用。該研究策略將為活體生物材料的設計和制備提供一種新的方法和視角。

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