定量蛋白質組學

     蛋白質組學研究的核心內容是蛋白質的動態變化和動態行為，即蛋白質的動態表達、動態定位、動態修飾和動態相互作用等，最終的研究目的是以大規模的尺度研究細胞內蛋白質的功能，這種研究要走向成熟必然要脫離對蛋白質的簡單鑒定，實現對蛋白質的表達水平及其存在形式變化的檢測。因此，定量技術應該說是整個蛋白質組學的精華部分。而這種定量通常不必是檢測蛋白質在細胞內的絕對含量，而只需對其相對含量進行定量即可。

     目前，蛋白質組研究中應用的比較成熟和可信的定量策略和方法主要有兩種。一種是基于傳統雙向凝膠電泳及染色基礎上的定量，另外一種是基于質譜檢測技術的定量。

    建立在傳統的雙向凝膠電泳和染色基礎上的定量方法，通過比較不同膠上蛋白質點的染色強度來進行相對定量。現有的染色方法包括銀染、考馬斯亮藍染色，還有最新的熒光燃料。染色在顯示蛋白質的存在的同時，還提供了其表達水平的信息。

     傳統的雙向凝膠電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術由O’Farrell和Klose等人于1975年建立。第一向為等電聚焦（Isoelectrofocusing，IEF），使蛋白質根據等電點不同進行分離，第二向為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），即將等電聚焦后的膠條放在SDS-PAGE上再根據蛋白質分子量不同進行電泳分離。由于具有高分辨率的特點，雙向凝膠電泳在蛋白質組學的研究當中始終占據著重要的地位。

     現在的雙向凝膠電泳技術第一向利用固相pH梯度（Immobilized pH Gradient，IPG）等電聚焦技術，具有上樣量大、分辨率高、重復性好等優點，并且可以提供蛋白質的等電點（pI）和分子量（MW）數值信息，有助于蛋白質的鑒定，而且雙向凝膠電泳膠上常見的isoform多是蛋白質翻譯后修飾的結果，對于這些蛋白質點的分析有助于了解對蛋白質功能影響重大的翻譯后修飾。但是雙向凝膠電泳技術本身也存在一些難以克服的缺陷，主要表現在兩個方面。第一，雙向凝膠電泳對蛋白質的分離受到蛋白質豐度、等電點、分子量和疏水性等的限制。對于低豐度蛋白質，由于上樣量的限制不能達到足夠質譜鑒定需要的量；對于極大蛋白質(相對分子質量>200 kDa)、極小蛋白質(相對分子質量<8 kDa)、極堿性蛋白質和疏水性蛋白質(膜結合蛋白質和跨膜蛋白質)，都難以進行有效分離分析。第二，雙向凝膠電泳操作費時費力，難以實現和質譜的直接聯用，不易自動化。

 

     目前在傳統雙向電泳技術的基礎上發展出的雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis, 2D-DIGE) (圖1)，采用專有的熒光染料與多重樣本和圖象分析的方法,在同一塊膠上可同時分離多個由不同熒光標記的樣品，并以熒光標記的樣品混合物為內標，對每個蛋白質點和每個差異都可以進行統計學可信度分析，從而具有良好的重復性和較高的準確率。另外，由于熒光染料的使用，使得雙向熒光差異凝膠電泳具有高靈敏度的特性，能夠滿足高通量定量蛋白質組學研究分析的要求。

     雙向凝膠電泳作為蛋白質組學最經典的技術手段，隨著本身的的不斷發展，染色技術的突破，樣品制備方案的改進，還將在蛋白質組學研究中繼續發揮作用。

     基于質譜的蛋白質組學定量技術的基礎在于肽段豐度可以用質譜峰的信號強度來表現，它可以分為兩大類：第一類為標記定量技術（Labeling quantitation），第二類則為非標記定量技術（Label-free quantitation），而前者則可更細分為體內標記（in vivo labeling）定量技術和體外標記（in vitro labeling）定量技術。

     標記定量技術的策略就是對來自不同樣品的多肽摻入一個內部標準(Internal Standards)，便于質譜識別不同樣品來源的肽段，同時標記與否的同一肽段的化學性質基本相同，這樣就可以確保同一次質譜掃描中兩者的離子化效率是相同的，質譜峰信號成對出現，而質譜峰的信號強度就可以作為定量的依據。這個內標必須滿足一定的條件，例如不同樣品來源的肽段標記后化學性質是相同的；如果和高效液相色譜聯用，標記后的肽段的保留時間盡可能相同等等。根據內標摻入手段的不同，標記定量技術又可以分為體內標記（in vivo labeling）定量技術和體外標記（in vitro labeling）定量技術。

     體內標記是指細胞或者個體在含有穩定同位素的介質中生長，穩定同位素被摻入合成的蛋白質，從而充當了蛋白質定量的內部標準。常見的體內標記方法有¹⁵N體內代謝標記和細胞培養中穩定同位素標記氨基酸(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture，SILAC)的方法。

¹⁵N體內代謝標記是用富含¹⁵N的介質來培養酵母、細菌和哺乳類等細胞，¹⁵N被摻入合成的蛋白質中，從而充當其定量的內部標準。蛋白質每摻入一個¹⁵N，所在的肽段將比正常¹⁴N的相同肽大一個質量單位，使得不同細胞狀態來源的肽段得到區分，肽質譜峰信號成對出現，從而根據質譜峰的信號強度進行準確的定量。但是這種體內標記策略有一個明顯的缺點，就是由于相同肽段的不同同位素標記形式之間的質量變化依賴于氮原子數目，因此對未知的蛋白質難以進行定量。

     細胞培養中穩定同位素標記氨基酸的方法（SILAC）是2002年由Ong等人發明的一種體內標記定量技術，現已發展的比較成熟，應用廣泛，主要操作流程如圖2所示。這種方法就是在培養介質中加入穩定同位素標記的必需氨基酸，主要用于高等動物細胞中蛋白質的鑒定及定量。因為高等動物細胞的生長中需要一些必需氨基酸的攝入，如賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等，而它本身無法合成這些必需氨基酸，需要從外界攝入補充。因此，在培養細胞時可以在培養介質中特異的加入用穩定同位素標記的某一種或者幾種必需氨基酸，在經過適當的培養時間，細胞中的蛋白質被標記完全后，收獲穩定同位素標記的細胞樣品。與正常介質中培養收獲的的細胞樣品混合酶解，質譜鑒定時就可以從質譜圖上得到成對出現的肽段信號峰，再通過相應的軟件如RelEx和MSQuant等就可以得到蛋白質相對定量信息。相比較而言，用Lys來標記明顯好于其他的必需氨基酸，因為當用胰蛋白酶(Trypsin)酶切時，保證了含有Lys殘基的每個肽段都只含有一個標記物，從而避免了未知肽段其他標記所帶來的質量變化不清的類似問題，而且有利于蛋白質做MS/MS鑒定時質譜圖的解析。

 

     由于體內標記技術不能實現對不可培養的樣本的定量分析，Ishihama等發明了一種拓展的SILAC技術，稱為culture-derived isotope tags(CDITs)，如圖2所示。該技術以穩定同位素標記的細胞樣品為內標，實現了對實際疾病狀態下組織樣品的定量。

總的來說，體內標記相對于體外標記方法具有一些自身的優勢，它省去了標記化學反應和分離純化等步驟，因而減少了樣品的損失。同時，體內標記也存在一些缺點。首先，它不能對組織來源的蛋白質進行分析；其次，培養細胞在富含穩定同位素的介質中生長，這些介質可能會影響細胞的繁殖和其他生物進程，由此改變蛋白質的表達水平；第三，這種方法受到同位素材料成本的限制，不可能對整個動物個體進行標記；最后，對于未知序列肽段，大多數的體內標記都無法確定標記物與肽段之間量的關系，從而使得我們難以確認同一肽段在質譜圖上成對出現的不同同位素標記形式。

 

     體外標記定量是指在體外采用化學反應將合成好的內標與蛋白質結合，這種方法由于增加了化學反應的步驟，會面臨樣品損失和標記不完全的問題，但是由于它使樣品來源不再局限于培養的細胞或者個體，可以實現對實際疾病狀態下的組織或體液樣品進行定量分析，從而具有良好的發展前景。

根據標記的蛋白質部位不同，體外標記分為以下幾種類型：N末端肽段標記，如iTRAQ；C末端肽段標記，如¹⁶O/¹⁸O標記策略；和一些特殊氨基酸標記，如半胱氨酸（cysteine）標記ICAT策略等。這里主要介紹一下實驗室常用的ICAT技術和新出現的iTRAQ技術。

     同位素標記的親和標簽（isotope-coded affinity tag，ICAT）技術作為一種體外標記穩定同位素的相對定量方法，已經成為重要的蛋白質組學定量分析方案。

     1999年，Gygi等人用化學方法合成一種能和半胱氨酸反應的親和試劑，稱為穩定同位素編碼的親和標簽，它有輕鏈和重鏈(穩定重同位素)兩種形式，可以在體外標記不同狀態下的蛋白質樣品，酶解并用親和柱分離純化被標記的肽段后，再用質譜進行分析，和體內標記法一樣也能夠得到成對的峰表示不同樣品中肽段及對應蛋白質含量的差異。這種穩定同位素親和標簽技術可以廣泛地應用在細胞和組織的定量蛋白質組學分析上，提供精確的蛋白質相對定量數據。

     目前ICAT方法已被商業化，應用廣泛。其試劑結構如圖4所示包括三個部分：頭部是和巰基反應的基團，使試劑共價結合在蛋白質側鏈上；中間的連接部分是同位素標記接頭，分為兩種：一種帶8個H（d0），一種帶8個D（d8）；尾部是親和標記的生物素，用于分離標記的蛋白質或多肽。目前常用的是改進的ICAT技術，稱為可剪切型ICAT（cleavable ICAT，cICAT），改用酸敏感的連接臂，降低了加到肽段上的相對分子質量從而提高了質譜檢測蛋白質的覆蓋率，試劑使用的標記過程也更加簡便、有效。另外，第二代¹³C -ICAT 試劑穩定同位素選用¹³C，而不是²H，這樣被試劑重鏈和輕鏈標記的肽段在色譜中的保留時間更具一致性，因此定量更為精確。

     但是ICAT技術每次實驗只能對兩個樣品進行相對定量，如果要比較多組樣品蛋白質表達水平的差異，將極大增加工作量和實驗誤差，在一定程度上限制了它的應用。

 

      新近出現的多重元素標記的蛋白質相對和絕對定量技術（isobaric tagging for multiplexed relative and absolute protein quantitation，iTRAQ）在一定程度上解決了這一問題。它是2004年由Applied Biosciences公司推出的一種可以同時對四組樣品進行定量分析的方法，對于實驗設計比較多組樣品給予了有力的支持。這種方法是建立在iTRAQ試劑的基礎上，試劑的結構及質譜鑒定機理如圖5所示。iTRAQ試劑是非多聚體的等質量標記試劑，是由四種試劑（114、115、116和117）組成的一組試劑，這四種試劑的分子量相同。每一種試劑都包括三部分：一個報告基團（分子量分別為114Da、115Da、116Da和117Da）、一個平衡基團（分子量分別為31Da、  30Da、29Da和28Da）和一個與肽段反應的基團。當我們需要同時比較四組不同樣品時，樣品分別跟四種iTRAQ試劑結合，然后混合在一起做質譜鑒定。

     iTRAQ試劑作為一種新穎且使用方便的蛋白質組學定量工具，盡管在發展之初面臨著軟件上的問題，仍然有著其特有的優越性，并且已經在疾病標志物的尋找和不同時段或者不同狀態的多樣本定量分析等蛋白質組學研究領域得到了很好的應用。

 

     以上介紹的基于雙向凝膠電泳的定量技術和基于質譜的穩定同位素標記定量技術由于分別有自身的缺陷，都沒有得到大范圍的應用。近年來科學工作者提出了一種新的不依賴于同位素標記的基于液相色譜串聯質譜的非標記定量技術(Label-free quantitative technology based on liquid chromatography tandem mass spectrometry, Label-free LC MS/MS)的，并被越來越多的研究者認可。

     現有的基于質譜的非標記定量技術主要有兩種：基于一級質譜信息和基于二級質譜信息。前者的依據是與一級質譜相關的肽段峰強度(Mass spectral peak intensity)、峰面積(Peak area)、液相色譜保留時間(LC retention time)等信息，后者的依據是與二級質譜相關的每個蛋白質鑒定到的肽段總次數(Peptide hits或Spectral counts)、所鑒定肽段的離子價位(Ion counts of identified peptides)等信息。William M. Old等人比較了兩類非標記定量技術的優缺點，但截止目前，label-free定量技術還在起步階段，還沒有一個較為統一的國際標準。

      利用肽段數對蛋白質定量建立在已有的研究認識基礎之上，就是在一個肽段混合物中，高豐度的肽段被質譜鑒定到的概率高于低豐度肽段，從而在一定程度上反映了蛋白質豐度。正是根據這一特性，Gao等利用肽段數（peptide hits）比值來對兩組樣品蛋白質進行相對定量，即所謂的肽段數技術（peptide hits technology，PHT），這種方法簡單便利；另外一些科學工作者基于類似的概念稱之為譜圖計數（spectral counts）來對蛋白質進行定量。

     非標記定量技術的關鍵問題是它定量的準確性以及與現有定量方法的相關性，很多工作對此進行了討論和研究。其中Zybailov等人用同位素標簽的樣品分析比較了肽段離子色譜面積定量（peptide ion chromatograms）和譜圖計數（spectrum counting）這兩種非標記定量方法，認為譜圖計數定量有較高的重復性和更大的動態分布范圍。Old等人也比較了譜圖計數（spectrum counting）和色譜峰面積強度（peak area intensity）這兩種定量方法，認為前者定量蛋白質差異變化的靈敏度較高，而后者的得到定量差異結果更精確一些。

      總的來說，非標記定量技術不需要同位素標簽做內部標準，具有經濟、高通量和省時省力等優點，在蛋白質組學領域開始興起。然而這種技術比較依賴于儀器的狀態、樣品的復雜性以及一些未知因素，用這些非標記定量技術去有效分析實際樣品差異的工作還不是很多。盡管如此，由于其特有的優勢，科學工作者還是不斷的發展和完善這些非標記定量技術，相信這些非標記定量技術將會得到越來越多的應用。