抗菌肽Adenoregulin 基因工程菌培養條件的優化及分批發酵研究

摘　要　Adenoregulin(ADR) 是來源于南美樹蛙Phyllomedusa bicolor 皮膚的含有33 個氨基酸的抗菌肽,在非極性環境中形成α-螺旋型結構,具有抗菌活性強、抗菌譜廣的特點。將ADR 基因克隆于pET32a 載體上,轉化大腸桿菌BL21(DE3) ,對這一工程菌株的培養條件進行了優化。通過正交試驗,考察誘導時機、誘導劑量和誘導時間三個因素的不同水平對蛋白表達的影響,結果發現誘導時機的影響尤為顯著,考察了9 種不同培養基對表達量的影響,發現培養基中加入葡萄糖對目標蛋白的穩定表達起了重要的作用,確定最佳培養條件為:培養基為2 ×YT + 015 %葡萄糖,誘導時機為OD600 = 019 左右,誘導劑IPTG加入的終濃度為011mmolPL ,誘導時間為4h。采用前期恒pH、后期指數流加的策略進行工程菌BL21(DE3)PpET32a-adr 的高密度培養,在整個流加過程中,通過控制葡萄糖的加入量,將菌株的比生長速率控制在0115h - 1 ,乙酸濃度也被控制在較低的水平( < 2gPL) ,但是質粒丟失嚴重,在發酵結束時,約有40 %的大腸桿菌中不帶質粒,這導致了目標蛋白的表達量下降嚴重,但是表達的目標蛋白90 %以上為可溶性形式。表達的融合蛋白無抑菌活性,而裂解后得到的ADR 單體具有明顯的抑菌活性。