液質聯用技術研究肽類藥物藥動學中的樣品制備技術

作者:戴舒佳，湯仲明，錢小紅

[摘要] 肽類藥物的研究開發成為新生物技術藥物研究開發的熱點之一。然而，建立可靠、靈敏和準確的肽類藥物體內分析方法是肽類藥物II占床前和臨床藥動學研究的難點。樣品制備技術是建立符合藥動學研究要求的定量分析方法的關鍵。現綜述液質聯用技術在肽類藥物藥動學研究中的樣品制備技術方法的目的、要求、特點和分類。結合近年發表的文獻具體闡述了固相萃取法、蛋白質沉淀法、超濾離心法、親和層析法和部分其他方法的原理及其應用實例。

Sample preparation by using LC-M S in pharmacokinetic studies of polypeptide drugs

DAI Shu-jia，TANG Zhong-ming，QIAN Xiao-hong

(Institute Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China)

[Abstract] The discovery of new polypeptide drugs is becoming one of the most favorable topics in the biotechnological medicine.It is considered as hard cores tO develop reliable and sensitive quantitative analysis in vivo，as well as the sample preparation technology，of polypeptide drugs for the preclinical and clinical pharmacokinetic studies.This paper reviews the objectives，requirements，classification and characteristics of sample preparations by using liquid chromatography tandem mas spectrometry (LC-MS)in pharmacokinetic studies of polypeptide drugs.It also introduces the principles and applications of variety of sample preparation methods including solid phase extraction，protein precipitation，ultra—filtered centrifugation and affinity chromatography.

[Key words] liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS);polypeptide drugs;pharmacokinetics;sample preparation

多肽是生物體內重要的生命物質之一，隨著肽合成技術和以噬菌體展示技術為代表的肽庫技術的推廣，大量候選多肽藥物應運而生。目前，國內外已有上百種多肽類藥物進入臨床前評價、臨床試驗或應用階段。然而建立可靠、靈敏和準確的肽類藥物體內分析方法是肽類藥物臨床前和臨床研究評價的難點和關鍵。該類研究主要采用同位素標記結合色譜分離法、免疫測定法和生物檢定法_，但上述各方法在精確區分和指認藥物原形和代謝物等結構相關信息方面體現了一定的局限性。對此，國內外均做了相對全面的比較和綜述。在過去的十多年中，隨著基質輔助激光解吸附電離和電噴霧電離接口技術的飛速發展，生物質譜與多種高效的分離手段特別是高效液相色譜的聯用(LC-MS)技術成為復雜組分中生物大分子定性、定量分析的有力工具_5 J。近年國外已有部分液質聯用技術應用于肽類藥物定量分析的研究論文發表。John等總結建立復雜生物樣品的肽類物質分析方法中，各類研究的焦點主要集中在樣品制備技術、內標物選擇和質譜裝置與檢測模式的選擇這2個方面。最近，Ji等首次提出了基于LC-MS定量分析生物樣品中相對分子質量較低的蛋白質、多肽藥物的策略，并指出阻礙該策略廣泛應用于體內蛋白質定量分析的瓶頸主要是生物樣品制備技術的問題。

現結合國外文獻重點綜述LC-MS在多肽類藥物藥動學研究中的各種樣品制備方法的目的要求、分類、原理及其應用，希望為國內順利開展相關研究提供參考。

1 LC.MS用于肽類藥物樣品制備的目的、要求、特點及分類

藥動學定量分析的特點要求在盡量短的時間內準確分析盡可能多的樣品。所以，該類研究的生物樣品制備總體趨勢是盡可能采用高通量的自動化或半自動化處理手段進行。但是，肽類藥物的結構、組成、性質與生物基質含有的大量蛋白質和多肽相似甚至相同，故其樣品制備過程較合成的小分子藥物有所不同，通常要求方法具有更高的靈敏度和選擇性。肽類樣品制備方法區別于傳統的小分子合成藥物，因為被分析物無論是組成和結構，還是理化性質均與生物樣品的基質蛋白質或多肽相同，這為該類藥物的提取、分離和鑒定分析工作帶來了極大的挑戰。目前文獻報道的各類技術中，根據操作方式的不同，生物樣品制備方法可分為離線模式(offline mode)和在線模式(online mode)兩種;根據方法原理不同，可大致分為特異性和非特異性方法兩大類。前者主要指親和層析法(affinity chromatography，AC);后者包括蛋白沉質淀法(protein precipita—tion)、固相萃取法(solid phase extraction，SPE)、超濾法(ultrafiltration)、灌注色譜法(perfusion chro.matography，PC)、阻定性進入介質(restricted accessmedia，RAM)的應用等。

2 常用的肽類藥物樣品制備技術的原理和應用

由于肽類分子的物理化學性質介于小分子有機物和大分子蛋白質之間，需充分考慮肽類分子和生物基質的理化性質以選擇適當的制備途徑。同時，限于目前質譜技術發展的階段，生物技術藥物分析中應用最多的還是相對分子質量較小的多肽類藥物。表1總結了近年應用LC.MS聯用技術定量分析蛋白質、多肽類藥物的部分具有代表性的研究實例。以下具體介紹幾種報道較多的肽類藥物樣品制備方法。

2.1 SPE SPE可以達到初步的去除雜質、脫鹽及濃縮被分析物的目的。

隨著可用于SPE的材料種類的增加及方便的小型器械的商品化，SPE在小分子及多肽類物質的研究中廣泛使用L1引。SPE的原理與柱層析類似，主要包含離子交換和反相色譜機制，洗滌和洗脫可用鹽溶液，水、甲醇、乙腈及其不同比例的混合液，也可用環己烷等非極性溶劑洗滌，從而有效去除疏水雜質。Ji等開發了半自動的96孔板SPE提取流程，實現了對相對分子質量為10 464的蛋白質分子的血漿樣品提取，且滿足臨床前研究的要求。文中還指出96孔板SPE形式的主

要優勢在于使用圓盤替代層析柱，減少了樣品的洗脫體積;與自動化液相處理系統保持了良好的兼容性，從而大大提高了樣品制備的通量。自動化的SPE方法結合柱切換技術，使單位臨床樣本的分析時間小于10 min，并且保持了粗分離和低變異。

2.2 蛋白質沉淀法

蛋白質沉淀法是一種快速的雜質蛋白質去除方法。常用的蛋白質沉淀劑包括乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等有機溶劑，高氯酸、三氯醋酸等有機酸，飽和硫酸銨等鹽類物質。通常在沉淀蛋

白質后離心，上清層可經揮干、重溶或不作處理直接進樣LC.MS分離分析。具有操作簡單，無需特殊裝置等優勢。然而，該方法由于沉淀劑的引入，同時產生了對色譜分離和質譜檢測步驟的不利因素。首先，由于非特異性的沉淀反應可能使微量的分析物隨著基質蛋白質共同沉淀而損失。其次，有機溶劑的引入可能影響后續的液相色譜分離效能，而有機酸和鹽類物質則在噴霧電離過程中抑制分析物的離子化效率，大大降低檢測靈敏度， Sibylle在利用乙腈沉淀血清蛋白質后發現多肽藥物隨著沉淀反應而有所損失;Yamaguchi等_在多肽KW-5139的定量研究中使用乙腈沉淀蛋白質后，上清層直接進樣分析獲得了滿意的結果，同時討論了不同pH值下分析物的多電荷離子分布情況。

2.3 超濾法

選擇適當相對分子質量截留的超濾管(1 000～3 000)，可以有效的實現肽類物質富集濃縮和脫鹽。但在使用時需注意到藥物與生物樣品基質的相互作用而降低回收效率。Fierens等直接將尿樣進行超濾處理，結合LC-MS成功的分析了尿中C-peptide的含量。

2.4 親和層析

作為樣品制備方法的親和萃取(affinity extraction)是基于固相化親和介質與其對應的目標分子特定結構域較強的特異性相互作用，分離復雜生物基質中特定組分的方法。親和提取法是目前富集效率和專屬性最高的樣品提取、富集手段之一。但目前用于肽類藥物定量分析研究的文獻較少，這主要是由于免疫親和層析和受體親和層析等方法的建立造價較高，選擇適當親和力的抗體或配基較難以及反應條件的通用性較差等。Kobayashi等首次報道了利用免疫親和層析技術提取人降鈣素(human calcitonin，hCT)的制備方法，并用于生物樣品中hCT 的提取定量分析。Ander—son等 J建立了利用穩定同位素作為內標物，利用抗特定肽段的抗體親和層析將肽段從復雜的生物體系中提取出來的方法，稱作SISCAPA(stable isotope standards and capture by anti.peptide antibodies)同時將此方法成功用于復雜樣品中指定蛋白質、多肽的定量分析中。

2.5 其他方法

灌注色譜是近年出現的一種基于分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。制成的固相萃取柱或液相柱，可以每分鐘幾十毫升

的高速上樣，尤其在生物樣品和培養基中蛋白質和肽類的分離、富集和除鹽，具有獨特優勢。Choi等改良了傳統的多步灌注色譜法(multistep perfusion chromatography，MSPC)，開發出一步灌注色譜法(single — step perfusion chromatography.SSPC)，并成功用于大鼠肝臟組織等復雜組分的蛋白質組研究中，獲得了增強的多肽信號。阻定性進入介質有兩層不同的表面，外層表面通過體積排除作用提供選擇性，并僅允許相對分子質量較小的分子進入內表面。內層表面通過傳統的分配作用捕獲分析物引。選擇適當填料，有望在肽類藥物研究中應用。但是，上述兩種方法尚未查到在復雜生物樣品中蛋白質、多肽的藥動學研究的報道。此外，為了適應高通量、自動化處理的要求，集成了多種分離、提取、分析模式的在線處理系統也不斷的研制開發并用于復雜生物樣品的研究中。在線處理系統包含了諸多符合大規模樣品制備或分離的裝置，一般較離線方式復雜，且成本較高。此外，由于分析目標不同，目前還沒有通用和成熟的商業化系統可供應用。

3 結語與展望

受到日益激增的樣品數量的影響，目前的樣品制備技術正向著自動化、高通量和專屬性強的方向發展。而選擇適當的方法仍然要考慮很多因素，包括樣品用量，提取方法的靈敏度、精密度、回收率、線性范圍和最低檢測限，合適的內標物等。越來越多的LC-MS方法被開發用于多肽類藥物的生物樣品分析，但由于樣品分析通量和靈敏度有限，現階段多肽類藥物的臨床前和臨床評價仍然采用免疫學方法為主。目前小分子合成藥物的評價大多采用質譜聯用的分析方法，肽類藥物乃至蛋白質類藥物要達到這個目標尚需要包括樣品制備、穩定同位素標記技術、質譜裝置和專業分析軟件等多方面技術的共同進步]。雖然，至今報道的使用LC-MS方法定量分析蛋白多肽類藥物的最大相對分子質量也僅為10 464，且靈敏度有限，但LC-MS對藥物原形分子的準確和精密的識別和定量分析是其他定量、定性技術難以比擬的。相信在不久的將來，隨著分離技術和質譜檢測技術的發展，基于LC-MS的快速、穩定、可靠、準確的分析方法能夠廣泛的應用于生物技術藥物的藥動學研究中。

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