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ICAT (Isotope-coded affinity tag )

上一篇 / 下一篇 2008-08-02 22:51:28/ 個人分類：蛋白質(組)項目服務

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原理

該技術由Gygi等提出，它主要是使用了一種稱為ICAT的化學試劑。其結構主要由3部分構成：

(1)親和標簽(生物素，biotin)，用來分離ICAT標記的多肽；

(2)連接子，用來整合穩定的同位素；

(3)活性集團，用來特異結合巰基(半胱氨酸)．試劑有兩種形式，稱之為“重”(連接子含有8個氘原子)和“輕”(連接子含有8個氫原子)；由8個氫原子或8個氘原子分別標記的ICAT分子量正好相差8。

當不同狀態的細胞被裂解后，分別加入不同標記的ICAT與總蛋白質反應。ICAT的反應基團會專一與蛋白質中的Cys共價結合，待充分反應后，將二者等量混合，再用胰蛋白酶酶解，HPLC分離，就可對含生物素ICAT酶解片段進行串聯質譜分析。

一對ICAT標記來源不同細胞狀態下的相同肽段總是一前一后相鄰分布在質譜圖上，且分子量正好相差8或4 D(肽段帶兩個電荷)。通過MS／MS鑒定出該片段屬于何種蛋白質后，計算二者峰值的差異，就可知這種蛋白質在二種細胞狀態下表達的情況。

Biomedical Node of the Australian Proteome Analysis Facility的網站中有關于DIGE原理的動畫。如有興趣，可以從以下鏈接瀏覽http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/ICAT/ICAT.html

優點:

ICAT具有廣泛的兼容性，主要表現在：(1)能夠兼容分析任何條件下體液、細胞、組織中絕大部分蛋白質；(2)烷化反應即使在鹽、去垢劑、穩定劑(如SDS、尿素、鹽酸胍等)存在下都可進行；(3)只需分析含Cys殘基的肽段，從而降低了蛋白質混合物分析的復雜性；(4)ICAT戰略允許任何類型的生化、免疫、物理的分離方法，因此能很好地定量分析微量蛋白質。

儀器：Finnigan LTQ

我們發表的論文

Jiang XS, Dai J, Sheng QH, Zhang L, Xia QC, Wu JR, Zeng R. A comparative proteomic strategy for subcellular proteome research: ICAT approach coupled with bioinformatics prediction to ascertain rat liver mitochondrial proteins and indication of mitochondrial localization for catalase. Mol Cell Proteomics. 2005, 4:12-34.