ASTM F2944-20
自動菌落形成裝置（CFU）分析的標準實施規程培養中細胞和菌落計數和表征的圖像采集和分析方法

Standard Practice for Automated Colony Forming Unit (CFU) Assays—Image Acquisition and Analysis Method for Enumerating and Characterizing Cells and Colonies in Culture

標準號

ASTM F2944-20

發布

2020年

發布單位

美國材料與試驗協會

當前最新

ASTM F2944-20

 

 

引用標準

ASTM F2998 ASTM F3294 ISO 20391-1 ISO 20391-2

適用范圍

1.1 本實踐描述了一種使用圖像分析對源自干細胞或祖細胞群的集落的數量和生物特征進行定量測量的程序。
1.2 這種做法適用于體外實驗室環境。
1.3 這種做法利用：(a) 細胞和集落圖像捕獲的標準化協議，這些細胞和集落源自在定義的視場 (FOV) 中對定義的起始細胞群體進行體外處理，以及 (b) 圖像處理和分析的標準化協議。
1.4 相關的 FOV 可以是二維的或三維的，具體取決于所詢問的 CFU 測定系統。
1.5 分析結果中使用的主要單位是 FOV 中存在的菌落數量。此外，還可以根據現有的形態特征、分布特性或使用二級標記（例如染色或標記方法）得出的特性來評估 FOV 內各個集落和細胞的特征和子分類。
1.6 成像方法要求以足夠的分辨率捕獲相關 FOV 的圖像，以便能夠檢測和表征單個細胞，并且 FOV 足以檢測、區分和表征集落作為評估的完整對象。
1.7 適用于二維和三維數據集的圖像處理程序用于將細胞或集落識別為視場內的離散物體。成像方法可以針對多種細胞類型和細胞特征進行優化，使用用于分割和聚類的分析工具，以指示共享譜系關系（即，克隆擴展）的方式通過接近度或形態來定義彼此相關的細胞組。單個創始干細胞或祖細胞）。
1.8 單個菌落對象的特征（每個菌落的細胞數、細胞密度、細胞大小、細胞分布、細胞異質性、細胞基因型或表型以及次級標記表達的模式、分布和強度）可以提供潛在生物學特性差異的信息的克隆后代。
1.9 在適當控制的實驗條件下，集落之間的差異可以提供有關起始群體內集落創建細胞 (CFU) 的生物學特性和潛在異質性的信息。
1.10 細胞和集落面積/體積、數量等可表示為細胞培養面積（平方毫米）或初始細胞懸浮液體積（毫升）的函數。
1.11 使用兩種或多種光學方法對 FOV 進行連續成像對于積累有關樣本中單個細胞或菌落物體的定量信息可能很有價值。此外，在過程跟蹤和驗證的設置中，需要對同一樣品進行重復成像。因此，這種做法需要一種使用定義的坐標系可重復識別 FOV 區域/體積內細胞和集落（質心）位置的方法。
1.12 為了實現足夠大的視場（FOV），可以在高放大倍率下將足夠分辨率的圖像捕獲為多個圖像場/圖塊，然后組合在一起以形成代表整個細胞培養區域的馬賽克。
1.13 對組織工程、再生醫學和細胞治療中常用的細胞和組織進行常規測定和分析，以確定原始干細胞和祖細胞群的數量、流行率、生物學特征和生物潛力。
1.13.1 常見適用的細胞類型和細胞來源包括但不限于：哺乳動物干細胞和祖細胞；成人來源的細胞（例如，血液、骨髓、皮膚、脂肪、肌肉、粘膜）細胞、胎兒來源的細胞（對于 1 此做法受 ASTM 醫療和外科材料和設備委員會 F04 的管轄，并且是TEMP 細胞和組織工程構建小組委員會 F04.43 的直接責任。當前版本于 2020 年 4 月 1 日批準。2020 年 6 月發布。最初于 2012 年批準。上一版本于 2012 年批準為 F2944–12。DOI：10.1520/F2944– 20. 版權所有 ? ASTM International, 100 Barr Harbor Drive, PO Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959. United States 本國際標準是根據《國際標準制定原則決定》中確立的國際公認的標準化原則制定的。世界貿易組織貿易技術壁壘 (TBT) 委員會發布的標準、指南和建議。例如，臍帶血、胎盤/臍帶、羊水）；胚胎干細胞（ESC）（即源自囊胚的內細胞團）；誘導多能細胞（iPC）（例如，重編程的成體細胞）；培養擴增細胞；以及特定類型組織的終末分化細胞。
1.13.2 與克隆集落內部和克隆集落間分化檢測相關的成熟分化表型的常見應用實例包括：造血表型（紅細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等）、成體組織特異性表型祖細胞表型（成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等）和其他組織（肝細胞、神經元、內皮細胞、角質形成細胞、胰島等）。
1.14 各種組織中干細胞和祖細胞的數量可以通過使用保留干細胞和/或祖細胞群的活力和生物潛力的方法從組織中釋放細胞，并將組織來源的細胞置于體外進行測定。細胞在體外環境中，導致干細胞和祖細胞作為克隆集落的有效激活和增殖。因此，可以根據觀察到的已形成的集落形成單位（觀察到的集落形成單位（oCFU））的數量來估計干細胞和祖細胞的真實數量（真正的集落形成單位（tCFU））（1-3） 2（圖A1.1）。干細胞和/或祖細胞的流行率可以根據檢測到的觀察到的集落形成單位（oCFU）的數量除以所測定的總細胞數來估計。
1.15 細胞和集落計數的自動圖像采集和分析方法（本文所述）已經過驗證，并發現與當前在明場或明場下手動觀察者定義的視覺細胞和集落計數的“黃金標準”相比，可提供卓越的準確度和精密度。帶或不帶血細胞計數板的熒光顯微鏡 (4)，減少觀察者內部和觀察者之間的差異。過去有幾個小組嘗試自動化此過程和/或類似過程 (5, 6)。最近的報告進一步證明了在細胞甚至核水平上提取各種細胞類型集落的定性和定量數據的能力 (4, 7)。
1.16 軟件和硬件的進步現在廣泛地實現了系統化的自動化分析方法。這種不斷發展的技術需要就本實踐中提出的測量單位、術語、過程定義和分析解釋達成普遍一致。
1.17 自動化 CFU 分析的標準化方法為提高 CFU 檢測在多個科學和商業領域的價值和實用性提供了機會：
1.17.1 自動化 CFU 分析的標準化方法為通過優化通用方案和優化 CFU 分析方法的特異性提供了機會。針對特定細胞類型和 CFU 測定系統的定量指標，可在不同實驗室之間統一應用。
1.17.2 自動化 CFU 分析的標準化方法通過提高通量和減少工作流程需求，為降低生物科學各個方面的菌落分析成本提供了機會。
1.17.3 自動 CFU 分析的標準化方法為提高實驗系統的靈敏度和特異性提供了機會，這些實驗系統旨在檢測體外條件、生物刺激、生物材料和體外加工步驟對附著、遷移、增殖、分化和生長的影響。干細胞和祖細胞的存活。
1.18 局限性描述如下：
1.18.1 集落鑒定——細胞來源/集落類型/標記變異性——來自不同組織來源和不同體外環境的干細胞和祖細胞會表現出不同的生物學特征。因此，檢測細胞或細胞核和所用二級標記的具體方法以及各自染色方案的實施將根據 CFU 測定系統、細胞類型和所詢問的標記而有所不同。用于檢測細胞和集落、定義集落對象和表征集落對象的圖像捕獲和圖像分析的優化方案將根據所使用的細胞來源和所使用的 CFU 系統而變化。這些協議需要在每個應用中進行獨立的優化、表征和驗證。然而，一旦定義完畢，這些就可以在實驗室之間以及跨臨床和研究領域進行推廣。
1.18.2 儀器引起的圖像捕獲變化——如果處理不當，上述圖像采集組件的選擇可能會對細胞分割和隨后的集落識別產生不利影響。例如，使用水銀燈泡而不是光纖熒光光源或光學器件的一般未對準可能會產生不均勻的照明或構成主要大視場圖像的平鋪圖像的漸暈。這可以通過在圖塊拼接之前對大視場圖像中的每個圖塊應用背景減法例程來校正。
1.18.3 CFU 分析系統相關的成像偽影變異——除了必須利用定義菌落識別的獨特特征呈現菌落物體外，來自每個 CFU 系統的每個圖像還可能呈現非細胞和非菌落偽影（例如例如，細胞碎片、棉絨、玻璃畸變、反射、自發熒光等），如果不加以識別和管理，可能會混淆細胞和集落的檢測。
1.18.4 圖像捕獲方法和質量控制變化——圖像質量的變化將顯著影響圖像分析方法的精度和再現性。焦點、照明、平鋪配準、曝光時間、淬火和發射光譜滲色的變化都是對圖像質量和再現性的重要的潛在限制或威脅。 2 括號中的黑體數字指的是本標準末尾的參考文獻列表。 F2944 ? 20 2 1.19 以 SI 單位表示的值被視為標準值。本標準不包含其他計量單位。
1.20 本標準并不旨在解決與其使用相關的所有安全問題（如果有）。本標準的使用者有責任在使用前建立適當的安全和健康實踐并確定監管限制的適用性。
1.21 本國際標準是根據世界貿易組織貿易技術壁壘（TBT）委員會發布的《關于制定國際標準、指南和建議的原則的決定》中確立的國際公認的標準化原則制定的。

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