HRP標記抗體的方法
?? 酶與抗體交聯的方法有許多種,根據酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備HRP結合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。
戊二醛二步法
1. 原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
2. 標記步驟：
(1) 稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
(2) 反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
(3) 將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3?小時。
(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。
(6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。
(7) 3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8) 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。
3. 結果判定：
(1) 定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定(?見本節?(三)工作濃度的選擇)。
(2) 定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程25px)。
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg／ml) ?IgG量(mg／ml)? 酶量
克分子比值＝────────?÷?───────?＝?───?×?4
40,000? 160,000 IgG量
(3) 本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶與蛋白質結合。
4. 試劑及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。
(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。
(3) 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
(4) 0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
(6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
(7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25層析柱(50px×1250px)。
(11)?攪拌器，分光光度計，離心機。
(12)?透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。
簡易過碘酸鈉法
本法是以NaIO４先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結合，所獲酶標記抗體的產率高，將近70％的HRP和Ig結合，99％的Ig與酶結合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。
1. 原理：經典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體。
2. 標記步驟:
(1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
(3) 將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
(5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混勻，再置4℃2小時。
(6) 將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過夜。
其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。
3. 結果判定：
除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
4. 試劑及器材:
(1) 0.1M NaIO４：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠，批號830602)溶于蒸餾水10ml中。
(2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:
0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml
加蒸餾水至2,000ml。
(3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:
Na２CO３?0.32克
NaHCO３?0.586克
加蒸餾水至50ml
再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。
(4) NaBH４溶液(4mg／ml):
臨用時稱取NaBH４4mg溶于1ml蒸餾水中。
(5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。
(三) 工作濃度的選擇
在免疫酶技術中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
酶標記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應，以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。
其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔內加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1％BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據據抗體的滴度而定)，分別加入反應孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H２SO４0.05ml終止反應。
結果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標，結合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率最大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。
有關試驗的試劑及器材均見ELISA部分。
要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實際應用中的最適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統中，因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法)，以達到最適的實驗條件。
(四) 注意事項
1. 在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高,效價高(最低1∶16),純度高，親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件。
2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，最好(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質)。否則，影響標記效果。
3. 室溫攪拌時須避光，室內溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。
4. 濃的標記物相當穩定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數周。已配制的使用液應在12小時內用完。切忌反復凍融。
