HRP標記抗體的方法(戊二醛二步法和簡易過碘酸鈉法)-2
（6）PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
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（7）萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
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（8）純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
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（9）HRP(RZ>3.0)。
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（10）Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
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（11）攪拌器，分光光度計，離心機。
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（12）透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。
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二、簡易過碘酸鈉法
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本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結合，所獲酶標記抗體的產率高，將近70%的 HRP和Ig結合，99%的Ig與酶結合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。
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1. 原理
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經典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體。
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2. 標記步驟
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（1）稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。
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（2）于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
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（3）將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。
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（4）加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA 5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
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（5）加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃ 2小時。
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（6）將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過夜。
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其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。
3. 結果判定
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除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
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IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
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4. 試劑及器材
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（1）0.1M NaIO4：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠，批號830602)溶于蒸餾水10ml中。
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（2）1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液：0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml；0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml；加蒸餾水至2,000ml。
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（3）0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液：Na2CO3 0.32g；NaHCO3 0.586g；加蒸餾水至50ml，再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。
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（4）NaBH4溶液(4mg/ml)：臨用時稱取NaBH4 4mg溶于1ml蒸餾水中。
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（5）其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。
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三、工作濃度的選擇
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在免疫酶技術中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
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1. 酶標記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應，以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。
2. 其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M
PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600(根據據抗體的滴度而定)，分別加入反應孔中，每個稀釋度二孔，每孔
0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H２SO4 0.05ml終止反應。
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3. 結果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值，并以OD為縱座標，結合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率最大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。
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四、注意事項
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1. 在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高、效價高(最低1:16)、純度高、親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件。
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2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，最好(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質)。否則，影響標記效果。
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3. 室溫攪拌時須避光，室內溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。
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4. 濃的標記物相當穩定，常加入30-40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1-2年，但稀釋成1:10，只能保存數周。已配制的使用液應在12小時內用完。切忌反復凍融。
