酶免疫技術抗體的酶標記方法
用于酶免疫技術的酶須具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室溫下穩定;反應產物易于顯現;能商品化生產。目前酶免疫技術檢測中常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(AP),其次還有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。
由于辣根過氧化物酶的比活性高,穩定,分子量小,純酶容易制備,所以最常用。HRP 廣泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP 由多個同工酶組成,分子量為40000,等電點為 pH 3～9,酶催化的最適 pH 因供氫體不同而稍有差異,但多在 pH 為5左右。酶溶于水和58%以下飽和度的硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白的最大吸收光譜分別為 403nm 和 275nm。一般以OD403nm?與 OD275nm?的比值 RZ(德文 Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶 RZ 值應在3.0左右(最高可達3.4)。RZ 值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,純度并不表示酶活性,如當酶變性后 RZ 值仍可不變。對于制備 HRP 結合物,可用戊二醛兩步法和過碘酸鹽法。
1、戊二醛法
戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。戊二醛交聯法有一步法和兩步法之分。一步交聯法是把一定量的酶、抗體、戊二醛同時加入到溶液中,在一定溫度下反應一段時間,然后用透析法或凝膠過濾法除去未結合的戊二醛即可得到酶結合物。在蛋白質與戊二醛交聯反應中,蛋白質賴氨酸基團是戊二醛最可能反應的部位,組成辣根過氧化物酶的300多個氨基酸中只有6個賴氨酸。市售的 HRP 中,只有1～2個賴氨酸基團可供交聯,而抗體分子中,賴氨酸基團的含量要大得多,因此,在一步交聯中,HRP 的反應性不強,抗體分子在戊二醛作用下形成聚合物,因此交聯反應后,必須用50%的飽和硫酸銨沉淀或用凝膠過濾除去聚合物。一步法酶結合物的產率僅6%～7%,其中 HRP 約占5%。在正常情況下,HRP 只有一個戊二醛分子的一個醛基反應,而第二個醛基不能與同一個或其他酶反應,即不發生聚合,故可將戊二醛先與 HRP 反應。產生的酶結合物中,其酶和抗體的物質的量的比接近1∶1,標記活性的損失比一步法少,但該法的效率也不高,僅有2%～5%的 HRP 標記在抗體分子上,標記的抗體只占25%,酶結合物的產率僅為10%～15%。在實際運用中,酶與抗體的物質的量的比在1～2之間為宜,但未標記的抗體嚴重干擾檢測結果,常用聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠過濾法除去未標記的抗體。
2、過碘酸鹽氧化法
該法只用于 HRP 的交聯。該酶含18%的糖類,過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉(NaBH4)中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑,可與蛋白質結合,形成按物質的量比例結合的酶標結合物。該法的交聯效果比戊二醛法好,結合物中 HRP 與抗體的物質的量的比在2～3之間,參與酶結合物中的HRP 可達70%,而抗體則可達99%。但是在標記過程中,酶活性和抗體的免疫活性損失較多。
