非標記抗體免疫酶組織化學實驗——酶橋法
由于在酶標記抗體過程中，酶與抗體的結合可損害部分抗體和酶的活性，從而降低了抗體的效價。另外，血清中的非特異性抗體也可以被酶標記，這些非特異酶標記抗體與組織中相應抗原結合，放大了非特異背景染色。為了避免酶標記抗體法的上述缺點，Sternberger（1969）在酶標抗體法的基礎上，創建了非標記抗體免疫酶技術。該方法先用酶（HRP 或 AKP）去免疫動物（羊、兔和鼠等），使其產生高效價、特異性的抗酶抗體，再將該抗酶抗體與酶結合，形成五環的復合物，例如 PAP（HRP）、APAAP（AKP）、OAGO（GO）復合物。該復合物由于沒有一個抗體受到共價鍵的標記，保留了免疫活性，相對分子質量較小，對細胞的穿透性好。該技術主要有酶橋法和過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）復合物法，以及一些變型的方法。特別是 PAP 法大大提高了檢測的敏感性，且染色背景輕，穩定性好，得到了廣泛應用。
| 實驗方法原理 | 首先用酶免疫動物制備成效價高、特異性強的抗酶抗體。在特異性抗體與抗酶抗體之間利用第二抗體作「橋梁」，將它們連接起來，再將酶結合在抗酶抗體上，經顯色顯示抗原的定位。 其基本流程為：抗原+特異性抗體 → 第二抗體（橋抗）→ 抗 HRP 抗體 → HRP → DAB+H2O2（顯色）。 因為橋抗體對特異性抗體的量是過剩的，與特異性抗體結合后還剩有抗原結合位點，能與抗酶抗體結合，所以橋抗體能起到連接特異性抗體和抗酶抗體的作用。在此過程中，酶是利用免疫學原理與抗酶抗體結合的，從而避免了由于酶標記抗體而引起的酶和抗體的活性損害，提高了方法的敏感性，降低了非特異性染色。染色原理見圖 4-7。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1. 石蠟切片脫蠟至水，冰凍切片或細胞涂片經丙酮固定 10 min，PBS 洗 3 min × 3 次。 2. 滴加 0.3% H2O2?甲醇液，室溫處理 20 min，PBS 洗 3 min × 3 次（抑內源性過氧化物酶活性）。 3. 0.1% 胰蛋白酶 37°C 消化 20 min 或 AR（只限于石蠟片），PBS 洗 3 min × 3 次。 4. 滴加 1:（5～20）正常羊血清或牛血清 20 min（室溫或37℃），吸去多余血清，不洗。 5. 適當稀釋的特異性一抗（例如來自種屬 A）37℃ 孵育 60 min 或 4℃ 過夜，PBS 洗 3 × 3 min。 6. 第二抗體（也稱橋抗體，抗種屬 A 的 IgG 抗體）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。 7. 抗酶抗體（來自種屬 A）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。 8. 酶（HRP 70～100 μg/ml，PBS 溶解）37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 × 3 min。 9. 0.04% DAB + 0.03% H2O2?顯色 8～12 min，最好在光鏡下控制。 10. 充分水洗，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化 15～30 s。 11. 常規樹膠封片，結果觀察。 展開 |
