非標記抗體免疫酶組織化學實驗——PAP 法
實驗方法原理 | 與酶橋法相似,不同的是酶橋法分四步,而 PAP 法分三步。PAP 法將酶橋法的步驟(3)、步驟(4)合二并為一,用 PAP 復合物替代,故稱 PAP 法(圖 4-9)。PAP 復合物中的抗 HRP 抗體和第一抗體必須為同一種屬動物的 IgG,這樣橋抗體才能作為「橋」將 PAP 復合物連接在第一抗體上,如特異性一抗為鼠來源的,那么 PAP 復合物必須用鼠的。 |
---|---|
實驗材料 | |
試劑、試劑盒 | |
儀器、耗材 | |
實驗步驟 | 1. 4 μm 石蠟切片 58℃ 烤片 4 h,切片常規脫蠟至水。 2. 蛋白酶消化或 AR(組織抗原的暴露或抗原的修復,此步視情況而定)。 3. 0.3% H2O2?處理切片 20 min(室溫),PBS 洗 3 min × 2 次。 4. 3% 正常動物血清處理切片 30 min(室溫),吸去多余血清,不洗。 5. 適當稀釋的特異性一抗孵育(4℃ 過夜或 37℃60 min),PBS 洗 3 min × 3 次。 6. 滴加橋抗體(二抗),37℃ 孵育 40 min,PBS 洗 3 min × 3 次。 7. 適當稀釋的 PAP 復合物(要求與特異性一抗同一種屬)37℃ 孵育 40 min。 8. PBS 洗 3 min×3 次。 9. 0.04% DAB-0.03% H2O2?顯色 8~12 min。 10. 水洗、復染、脫水、樹膠封片,結果觀察。 展開? |
注意事項 | 1. 假陰性及其處理 應用 PAP 法顯示抗原含量較多的組織或冰凍切片抗原保存良好的標本時,可導致陰性結果。Bigbee(1977)的研究證實,陰性結果是由于第一抗體用董過高,與組織抗原結合過多,使相鄰兩個抗體的 Fc 段間的距離恰好是連接抗體的兩個 Fab 段結合的長度,于是連接抗體不存在游離 Fab 段,僅存無活性的 Fc 段,所以不能將 PAP 復合物連接在與組織抗原結合的第一抗體上,導致陰性結果。尤其是冰凍切,而石蠟切片很少發生這種現象。克服的辦法是將第一抗體盡量稀釋。 2. 橋抗體 也稱連接抗體。它的兩個 Fab 段具有相同的結構、性質及與抗原結合的能力,因此,當第一抗體和 PAP 復合中抗 HRP 抗體來自同一種屬動物時,橋抗體能同時與上述二種抗體結合,起到橋的作用。為丁確保橋抗體的二個 Fab 段之一與第一抗體結合,另一個與抗 HRP 抗體結合,橋抗體的濃度必須高于常規用的第二抗體。 3.PAP 復合物 在 PAP 法和酶橋法中,特別強調第一抗體和抗 HRP 必須來自同一種屬,橋抗體才能發揮橋的作用,將其連接在一起。 展開 |
-
會議會展