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優化樣品前處理實現草本茶中農藥殘留的LC/MS/MS分析

2020.3.04

采用預稱量的試劑盒優化QuEChERS方法，實現快速簡便的方法開發。該法可以充分凈化高度著色的樣品，大多數農藥的回收率高，重現性好，平面結構農藥沒有明顯的保留損失。

草本茶已深深融入到多種文化中，通常被認為能夠改善身體健康狀況，降低各種疾病的發生，例如癌癥、中風和骨質疏松癥等。對茶的高需求量，要求實施現代化的農業生產方式，包括施用農藥來維持茶收成的穩定。無論是允許還是禁止使用的農藥，其最大殘留限量越來越低，因此對草藥制品中頗多種類農藥的檢測就需要快速、穩定且高效的方法。該方法中至關重要的一步就是樣品前處理，尤其針對植物性基質，它們往往非常復雜，且包含有干擾的基質化合物，導致離子抑制、共流出和儀器污染。

本研究采用快速、簡便、經濟、高效、耐用且安全的稱之為QuEChERS 的技術完成草本紅茶和綠茶樣品的前處理。QuEChERS 包括如下三個簡便的步驟：1) 采用有機溶劑和分配劑鹽進行萃取;2) 采用吸附材料(分散吸附劑)進行樣品凈化;3) 液相色譜或氣相色譜分析，或兩者均采用[4,5]。分散凈化吸附劑包括C18、N-丙基乙二胺(PSA) 和石墨化碳黑(GCB)。對于包含大量色素的茶樣品，GCB 的使用越來越重要;但必須謹慎使用，因為它也會移除目標分析物，尤其是具有平面結構的化合物。

實驗條件

儀器條件

液相色譜：Agilent 1290Infinity液相色譜儀 Agilent6410三重四級桿液質聯用系統;質譜離子源參數：色譜柱：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18,2.1×150mm，1.8μm;洗脫液：A:水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸;進樣量：10μl;0.2ml/min;柱溫：22℃;模式：ESI⁺;干燥氣溫度：300℃;干燥氣流速：7L/min;霧化器壓力：35psi;毛細管電壓：3500V。

梯度程序：

時間（min）	%B
0.0	5
0.5	5
5.0	60
7.0	80
12	95
15	95

材料

HPLC 級乙腈(Honeywell International, Inc);反滲透水采用Millipore水純化系統制備。甲酸(98%)(ACS級，Sigma-Aldrich 公司);茶樣品來自多家供應商;標樣(Accustandards公司);為濃度100μg/mL的乙腈溶液。將它們混合并用乙腈稀釋到適當濃度，儲存在冷凍箱(–3oC) 內。

實驗分析

樣品前處理

萃取：適用于10g樣品的Agilent Bond Elut QuEChERS Original萃取管( 部件號5982-5550);分散SPE凈化：Agilent Bond Elut QuEChERS分散通用試劑盒，15ml分散SPE管(400 mg PSA，400mg C₁₈，45mg GCB，1200mg MgSO₄)(部件號5982-0029);過濾：Captiva Premium注射式過濾器，尼龍膜，15mm，0.2μm(部件號5190-5088)

QuEChERS 萃取

稱取干茶葉1±0.01g，置50 mL離心管中，按照要求給樣品加標。于離心管中加水10ml，加蓋并渦旋1 min。樣品徹底潤濕后，將濃度50 ng/mL的內標(樂果-d6、敵草隆-d6和二嗪農-d10)乙腈溶液(10 ml) 加入離心管中，加蓋，手動振搖1 min，然后置超聲水浴中超聲15 min。取出離心管，加入Bond Elut QuEChERSOriginal萃取鹽(4g MgSO₄，1g NaCl)，然后將離心管手動強力振搖1 min。隨后將樣品以4000 rpm的轉速離心5 min，實現水相和有機相溶劑的分離(圖1，步驟1)。

分散固相萃取

離心后，將6 ml上層乙腈溶液轉移到Bond Elut QuEChERS分散通用試劑盒的15 ml離心管中。將離心管渦旋1 min，然后以4000 rpm的轉速離心3 min。離心后，取2 ml凈化的萃取液加入10ml試管中，氮氣流吹至近干。采用0.7ml H₂O + 0.1%甲酸(FA) 混合溶劑、0.2ml乙腈，以及0.1ml乙腈或校準標準液復溶樣品。接著，將樣品注射式過濾至自動進樣器樣品瓶中，用于LC/MS/MS分析(圖1，步驟2)。

校準曲線和線性

通過混合安瓿中的認證標準液來制備儲備標準液。將儲備標準液用乙腈適當稀釋來制備工作標準液。溶劑復溶時，將適量的工作標準液加入經QuEChERS萃取的空白綠茶和紅茶樣品中，制備基質匹配的標樣，濃度分別為0.5、1、5、10、20、50、100 和200ng/mL。將三種內標加入所有樣品，濃度50ng/mL，并采用完整QuEChERS工作流程進行萃取。通過這些標樣得到線性校準曲線，R2不小于0.992(數據未顯示)。

結果與討論

QuEChERS萃取鹽和凈化試劑盒的選擇

為了實現最高的回收率和重現性，本研究評價了幾種萃取鹽試劑盒。在測試了Bond Elut QuEChERS Original、AOAC 2007.01和EN15662萃取鹽后，我們發現包含1g NaCl和4 g MgSO₄的原萃取試劑盒可獲得總體上最高的回收率。由于大量色素會與目標分析物一同萃取出來，因此，選擇包含GCB的分散凈化試劑盒是非常必要的。我們發現，使用包含PSA、C₁₈、GCB和MgSO₄的Bond Elut QuEChERS通用試劑盒，可以獲得明顯更潔凈的樣品，以及更高的回收率，并且僅極小到中等程度地保留平面結構農藥(多菌靈、噻菌靈、三環唑和嘧霉胺)。

回收率與重現性

對于綠茶和紅茶基質中的176種農藥，絕大多數使用本方法均可獲得優異的回收率和重現性。對于綠茶樣品，濃度10 ppb 82%農藥的回收率和濃度100 ppb 92%農藥的回收率，均在70 - 120%范圍內。對于紅茶樣品，濃度10 ppb 76%農藥的回收率和濃度100 ppb88%農藥的回收率均在70 - 120%范圍內。如圖3所示，還有較少農藥的回收率低于50%并且有一些農藥未能檢出。

小結

本文優化了QuEChERS樣品前處理方法，實現對草本綠茶和紅茶中176 種農藥LC/MS/MS 分析。在UPLC/MS/MS平臺上，該方法可以實現快速分離和高靈敏度檢測。樣品前處理可以充分凈化高度著色的茶樣品，并且大多數農藥均可獲得高回收率。

盡管LC/MS/MS是農藥殘留分析的一款強大工具，但它并不適合分析適用于GC分析的某些類農藥。將來的研究將探討采用GC/MS/MS優化分析干燥植物基質中的農藥。這些適用于GC 分析的農藥中，有一些可以被GCB吸附劑所保留，因此，必須小心權衡樣品的凈化與色素的清除，確保分析物達到一定的回收率。LC和GC工作流程的結合，將為綠茶和紅茶中農藥分析提供完整的解決方案，并且提供了可以進一步轉換為分析其他高度復雜干植物基質的方法學。

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