迄今為止，文獻報道的就有超過 65 個從斑馬魚上篩選出來的小分子（表 1）。這些篩選出來的小分子在斑馬魚上從胚胎形態到心臟和睡眠等都有不同的表型。其中一些是老藥新用，一些則是剛剛發現的新型化合物。這里，我們重點關注那些在斑馬魚上發現的有希望揭露不同治療方法的疾病相關的化合物。

新藥研發

Prohema Prohema 是前列腺素 E2（PGE2，PGE2 之所以能促進 HSC 的生產能力與 WNT 信號通路有關）的一個穩定的衍生物，目前處于臨床 II 期，實驗者為接受臍帶血（UCB）移植的白血病或淋巴瘤的患者。起初，Prohema 之所以會被在斑馬魚上被篩選出來是因為它會增加或減少造血干細胞（HSC）的數量。我們用自動原位雜交法給胚胎主動脈-性腺-中腎區的 HSC 染色，進而篩選出提高或降低 HSC 數量的藥物。Prohema 的治療潛力最早在成年斑馬魚被展示，它增強了斑馬魚在亞致死照射后骨髓恢復的速率。在小鼠中，全骨髓暴露于 Prohema 的體外能形成更多脾集落形成單位。同樣，Prohema 處理的全骨髓能更有效地重建造血系統，并制造出 HSC。 對于人類接受 HSC 移植作為治療白血病或淋巴瘤的手段，UCB 已成為可移植的 HSC 的重要來源。然而，存在于標準 UCB 樣品中的 HSC 個數通常不足以治療成人，因此，Prohema 提高 HSC 數量和其再植能力的作用就變得十分重要。 Dorsomorphin Dorsomorphin 及其衍生物是骨形態發生蛋白（BMP）受體的抑制劑：在人類中被稱為活化素受體樣激酶 2（ALK2，也被稱為 ACVR1），在斑馬魚則是 Alk8（也稱為 Acvr1l）。這些化合物目前正在開發中，用于治療進行性肌肉骨化癥（Fibrodysplasia ossificans progressiva，FOP）和炎癥性貧血（圖 1）。Dorsomorphin 是在斑馬魚上找尋能影響早期胚胎發育基礎身體和器官的形成的物質時被發現的。在篩選一個有幾千個化合物的化合物庫時發現了一個吡唑并嘧啶化合物，經鑒定其會導致背部化——即背部組織的過度擴增代替的腹側組織。經它處理的斑馬魚胚胎發育后表現為尾部斷裂或缺失。之后，這個吡唑并嘧啶被命名為 dorsomorphin，以此反映其背部化活性。 背部化吡唑并嘧啶此前被描述為 AMP 活化的蛋白激酶的抑制劑（AMPK），但其他的 AMPK 卻不能復制其在斑馬魚胚胎的表型，這表明了 AMPK 不是背部化的靶點。相反，dorsomorphin 處理過的動物是很難與一種隱藏在 Alk8 突變中的叫做 lost?a?fin 的遺傳突變疾病相區分。這種表型相似性表明，dorsomorphin 可能抑制了斑馬魚的 Alk8，對應到人則是 ALK2——這一假設已經被證實。 極度活躍的 BMP 信號通路會引起多種疾病，包括 FOP 和炎癥性貧血。作為 BMP 通路的第一小分子抑制劑，dorsomorphin 衍生物 LDN-193189 已在嚙齒動物模型上被證明是有效的治療 FOP 的和炎癥性貧血。此外，它已在哺乳動物模型上被證明是有效的治療其他 BMP 相關疾病，包括動脈鈣化和炎性腸病的藥物。由于 BMP 抑制劑有著治療此類疾病的良好效果，dorsomorphin 和臨床前開發衍生品已經通過了美國衛生國家機構的 TRND（重點罕見或易忽略疾病治療）和 BrIDGs（彌補干預療法開發鴻溝）方案，將用于治療 FOP 和早期臨床試驗中的炎癥性貧血。 PROTO?1 氨基糖苷類抗生素可以通過殺死聽細胞導致聽力損傷，PROTO-1 及其結構上類似的苯并噻吩甲酰胺類是目前正在被開發用于預防抗生素引起的聽力損傷。用斑馬魚篩選了 10960 個化合物后終于確定了一些能保護聽細胞免受氨基糖苷類的傷害的化合物，被認為是斑馬魚強有力的耳保護劑。PROTO-1 的制作現已被授權給致力于開發苯并噻吩甲酰胺類的耳保護劑的 Oricula 治療公司。Oricula 表示，先導物優化產生的類似物與 PROTO-1 相比效能超過 100 倍，且更安全。

老藥新用

除了發現具有治療潛力的新的化合物，斑馬魚已經被用于鑒定一些現有的藥物, 看看是否能鑒定出新的用途。利用已有藥物進行篩選可以提供一種更容易通過臨床調查，因為它們已經被批準, 至少已經通過了藥代動力學分析和安全測試 cox 抑制劑 通過轉入人急性髓性白血病 (AML) 致癌基因 AML1-ETO 建立斑馬魚 AML 模型, 其骨髓原始細胞的累積與患者十分相似。明顯的白血病相似表型和白血病形成時的 WNT–β-catenin 信號，都可以從已有藥物中鑒定出環氧化酶（COX）抑制劑。在老鼠中實驗也證明 WNT–β-catenin 信號是白血病干細胞自我更新所必須的。更甚者，用 COX 抑制劑處理小鼠 AML 模型后發現其成功抑制了白血病癌細胞的轉移和增殖。又因為 COX 抑制劑已被批準使用且在人體身上反應較好，因此，此藥可能將會快速通過 1 期直接進入臨床試驗。 糖皮質激素 kcnh2 基因沉默后建立斑馬魚 QT 間期延長綜合癥模型，具有動作電位延長和 2:1 房室傳導阻滯的特征。通過表型和相關通路的鑒定，用斑馬魚模型從現有的藥物中識別到糖皮質激素氟氫縮松為 LQT 綜合征治療藥物。和哺乳動物相比有更高的分辨率，證明葡糖類皮質激素能縮短 LQT 心臟的動作電位持續時間。現在美國馬薩諸塞州總醫院關于糖皮質激素地塞米松在 LQT 綜合征患者的臨床試驗已經開始了。早期結果與地塞米松可能會縮短在人類患者的 QT 間隔的假設是一致的。

確定作用機制上的挑戰 與其他基于表型的小分子篩選相比，確定斑馬魚發現的小分子的作用機制（MOA）仍是最顯著的障礙。雖然具有挑戰性，MOA 研究仍是基于表型的藥物篩選中最有價值的部分，因為他們往往是意想不到的或革命性的巨大新發現。其它研究表明有大量的計算機技術、生物和遺傳技術都可以用于斑馬魚發現的小分子的機制研究中，并且已有多個成功的示例。例如，在 T 細胞急性淋巴細胞白血病（T -ALL）斑馬魚模型，親和色譜法聯用質譜層析法被用來鑒定奮乃靜（一種殺死 MYC 過度表達胸腺細胞的抗精神病藥）的作用靶點——蛋白磷酸酶 2A（PP2A）的 Aα亞基。類似地，親和層析用于證明線粒體蘋果酸脫氫酶是 visnagin 的靶點，visnagin 是在斑馬魚心臟疾病藥物篩選中篩出的心臟保護化合物。 除了通用的方法來確定藥物作用機制，也有用斑馬魚來鑒定機制的，其中最有效的方法就是斑馬魚基因沉默結合斑馬魚表型。藥物引起的表型和遺傳突變引起的表型之間的相似性往往能為識別提供線索，進而確定藥物靶點（圖 2）。例如上述的 dorsomorphin，lost?a?fin 突變的表型就證明了 BMP 通路就是 dorsomorphin 的作用靶點。胚胎時用 dorsomorphin 處理的斑馬魚丟失他們的腹側的尾鰭——這樣一個不尋常的表型，卻與 lost?a?fin 突變后的表型幾乎完全一致，說明 dorsomorphin 抑制 ALK2，由是突變破壞了蛋白質。 有一個更近的例子，斑馬魚胚胎發育藥物篩選實驗中發現 kalihinol F 會造成幾個獨特的發育缺陷，包括脊索起伏和色素沉著、造血系統和神經發育上的缺陷。而苯氧類化合物被確定會造成相似的缺陷，一種銅轉運 ATP 酶 atp7a 功能被破壞的斑馬魚突變體。此相似的表型充分說明了其相關性，事實上，外源銅可以拯救 kalihinol F - 誘導的斑馬魚發育缺陷疾病，而 kalihinol F 能夠搶救銅中毒的斑馬魚胚胎和哺乳動物細胞。 應當指出的是，這種通過多維表型匹配來確定機制的方法還可以用于那些起初不是由斑馬魚發現的化合物上。就像煙曲霉素，一種抗血管生成的自然產物，被發現已經超過 60 年，而它的靶點蛋氨酸氨肽酶-2（MetAP-2）被發現不超過 15 年。用 fumagillin 處理過的斑馬魚有一個十分特別的原腸胚形成表型，而這個表型與非典型的 Wnt5 突變的表型十分相似，說明 fumagillin 造成的 MetAP-2 抑制最終破壞了非經典 Wnt 信號通路下游受體的結合。 其他藥物研究中的斑馬魚應用 雖然大部分在斑馬魚化學生物學學術努力一直專注于小分子的發現，但這絕不是斑馬魚在促進藥物發現和發展中唯一的選擇。事實上，工業中常將斑馬魚用于毒理學實驗，大多數大型制藥企業都會公布一些使用斑馬魚的毒理學數據。值得指出的是，斑馬魚的毒理學作用往往與哺乳動物的不同。由于成本低又省力，斑馬魚可以更早地用于臨床前開發。例如，可以高通量篩選數百或數千個化合物，也可以在早期階段消除候選毒性化合物，進一步優先實驗并提高命中率，節省大量之前會被浪費的資源。 正如前面所說，斑馬魚已被證明是用于預測幾種類型的藥物毒性的良好模型（ 圖 3）。比如，心臟毒性，在斑馬魚和人之間是高度保守的。藥物的系統研究表明，導致人體QT 間期延長的藥物 >95％ 在斑馬魚上也有類似的效果。類似地還有肝毒性，腎毒性和生殖毒性，其中所有的在臨床前模型哺乳動物或人類上鑒定過的已知毒物在斑馬魚上都有類似的效果。然而，這還需要付出相當大的努力，進一步評估各個毒性，以建立斑馬魚和人毒理學之間的規范。 斑馬魚的未來 基因工程 轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALENS）和 CRISPR-CAS 的出現極大地改變了以斑馬魚為基礎的研究。在過去 2 年里，CRISPR-CAS 技術使靶基因功能喪失或獲得性快速突變變成了可能，并首次使在斑馬魚上重新創建人類疾病的等位基因成為了可能，這對藥物發現的潛在影響無疑是巨大的。隨著大量的人類疾病相關基因的發現，如何將這些理論轉化為治療方法逐漸成為重點。由于斑馬魚突變體制作簡單，表型突出，與嚙齒動物相比，斑馬魚很可能是用于測試候選疾病基因的流行選擇。隨著基因編輯技術的不斷改進，在斑馬魚上重現幾十或幾百種人類基因突變，隨后對其表型進行快速評估，并用于篩選疾病相關的化學抑制劑 行為儀篩選新型神經活性藥物 神經系統疾病，可以說是藥物篩選中最難的部分。盡管對于神經系統疾病的患病，通常有幾個有效的藥理學療法。開發新的中樞神經系統（CNS）藥物是緩慢的，昂貴的，充滿了失敗。挑戰包括現在只有少數幾個神經疾病的靶點被發現和難以創建合適的 CNS 疾病模型。精神病的表現，如抑郁癥和精神病又難以在動物中表現出來，神經變性終點往往發展緩慢且難以量化。 斑馬魚行為篩選模型提供了一個有趣的中樞神經系統藥物發現替代方法。斑馬魚具備豐富的行為，包括簡單的刺激-反應行為和更復雜的行為，如學習和睡眠能力，這些行為可以在 96 孔板中研究。雖然斑馬魚和人的行為不同，但根本的回路、細胞和受體是相似的。因此，通過斑馬魚來篩選相似回路上的作用藥物就變成了可能。例如，它可能難以分辨斑馬魚是否有精神分裂癥或精神分裂癥，但可以分辨出疾病相關的的蛋白和細胞。抗精神病藥物會對這些蛋白質和細胞進行調節，進而引起特定和獨特的行為改變，確定合適的化合物。研究表明，在斑馬魚的行為試驗中，某些公認的神經活性藥物能產生獨特的和可再現的行為特征，建立相應的行為學模型可以高通量篩選出具有類似行為效應的新的化合物（圖 4）。或者使用基因工程技術在斑馬魚上重建人類疾病機相關的突變，突變后篩選抑制異常行為并能恢復正常行為的化合物。 未解決的問題和存在的挑戰 斑馬魚模型雖然擁有很大的前景，但也面臨著巨大的挑戰。其中最顯著的問題是藥物暴露的控制和定量。雖然很容易控制在水中的藥物的暴露濃度，但難以預測多少藥物將被斑馬魚吸收。有些藥物似乎吸收不良，而另采取了一些容易的方法。藥物水平通常在血清或哺乳動物模型組織中直接測量，但這些測量更具挑戰性，使斑馬魚在高通量上得應用造成了阻礙。雖然 logP 等一些物理化學屬性也能預測斑馬魚的藥物吸收，但這仍然是不完善的，一旦此方法被改進，無疑會使斑馬魚在藥物篩選上的應用更加成熟。 當然，其他一些挑戰也依然存在。例如斑馬魚的表型分析，尤其是復雜的表型，例如動物的自然變異等，當然，這個可以通過建立許多不同的研究小組進行（表 1）。另一個挑戰是生產足夠的斑馬魚，實現真正的大規模高通量篩選。改進的大規模生產和處理斑馬魚胚胎的方法將第非常有益的。 【環特生物】中國首家斑馬魚生物技術服務公司（CRO），面向醫藥、化工、食品、環境等領域，提供藥物研發、安全性評價、毒理學研究和生物醫學研究等專業服務。