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五、RNA探針制備（根據the DIG system user's guide） A． 地高辛標記的體外轉錄 試劑及其配制（試劑盒提供）： 10× NTP標記混合物：in Tris-HCl (pH 7.5) 10mmol ATP 10mmol CTP 10mmol GTP 6.5mmol UTP 3.5mmol DIG-UTP 10× 轉錄緩沖液：400mmol Tris-HCl(pH 8.0) 60mmol MgCl2 100mmol DTE(dithioerythritol) 20mmol亞精胺 100mmol NaCl 1unit/mlRNase抑制劑。 10unit/μl DNase I (RNase-free) 20unit/μl Rnase抑制劑 20unit/μl T7 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶 4mol/L LiCl 200mmol/L EDTA DMPC-H2O

試驗程序（帶手套操作） 1．在一經DMPC處理并高壓滅菌的無Rnase污染的微型離心管中依次加入下列反應物（離心管置于冰上）：線性化模板DNA 4μl(1μg) 10×NTP標記混合物 2μl 10×轉錄緩沖液 2μl DMPC－H2O 10μl T3或T7 RNA聚合酶 2μl 2．輕輕混勻反應物，37℃保溫反應至少2小時。 3．如果必要，向反應體系中加入2μl無Rnase污染的DnaseI，37℃下再保溫反應15min.以除去殘留的DNA模板（由于DIG標記的RNA轉錄量大大超過DNA模板量，因此，這一步有時也可以省略）。 4．向反應體系中加入2μl 200mmol/L的EDTA終止轉錄反應。 5．再向反應體系加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷100%乙醇，4℃下沉淀過夜 6．4℃下，12000rpm離心15min.，沉淀用70%冷乙醇洗滌一次，真空干燥。 7．沉淀按1μg/10μl的濃度重懸于DEPC-H2O中（每一反應體系約10μg），并向其中加入20unit Rnase抑制劑，置于-20℃保存備測，檢測后按一次雜交使用的體積分裝再置于-70℃下保存。 DIG標記的RNA在-70℃條件下可以穩定地保存至少1年。 B. DIG標記有效性檢測 RNA轉錄物能通過瓊脂糖變性膠電泳檢測其探針完整性。標記效果可通過抗DIG堿性磷酸酶直接檢測，有兩種方法可以選擇。 方法一、用標準DIG測試條比較鑒定 使用測試條鑒定包括兩個步驟：首先，將轉錄標記的RNA稀釋成一系列的濃度，并點樣到空白測試條上（對照測試條已用一系列濃度點樣）；其次，將點樣的備測試條與對照測試條一起進行免疫、顯色反應，然后根據對照測試條計算備測樣品的濃度。 試劑及其配制 20×SSC：3mol/ NaCl(175g/L) 0.3mol/L 檸檬酸三鈉?2H2O(88g/L) pH 7.0 RNA稀釋緩沖液：DMPC-H2O/20×SSC/甲醛(5:3:2) Anti-DIG-AP NBT溶液：75mg/ml NBT溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中 BCIP溶液：50mg/ml BCIP溶解在DMF中 DIG空白試劑條：帶正電荷的尼龍膜 對照試劑條：在相同膜上已用不同濃度的DIG標記DNA點樣（300,100,30,10,3pg） 洗膜緩沖液：100mmol Maleic acid 150mmol NaCl 0.3%(v/v) Tween20 pH 7.5 Maleic acid緩沖液：100mmol Maleic acid 150mmol NaCl pH 7.5 封閉液：5% (w/v) SDS 17mmol/L Na2HPO4 8mmol/L NaH2PO4 室溫保存，如果需要，用0.45μm的濾膜過濾除菌。 檢測緩沖液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5) 100mmol NaCl TE緩沖液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0) 1mmol EDTA 試驗程序（帶手套操作） 1．將轉錄反應物稀釋成濃度約為1μg/ml，即取前述轉錄標記物1μl加入99μlRNA稀釋緩沖液，如果轉錄標記反應正常其濃度應大約為1μg/ml。 2．取5支Eppendorf管，按A、B、C、D、E順序編號，將1μg/ml濃度的RNA標記物按下列方式稀釋成一系列濃度： 編號 RNA標記物稀釋方法 RNA終濃度 A 1μg/mlRNA 10μl＋RNA稀釋緩沖液23μl 300pg/μl B 1μg/mlRNA 5μl + RNA稀釋緩沖液45μl 100pg/μl C A 5μl + RNA稀釋緩沖液45μl 30 pg/μl D B 5μl + RNA稀釋緩沖液45μl 10pg/μl E C5μl + RNA稀釋緩沖液45μl 3 pg/μl 3．將空白測試條置于一聚酯膜上，以每一濃度1μl的量在測試條上點樣，在聚酯膜上做好點樣濃度標記，切勿直接在測試條上做任何記號，切勿用手接觸測試條。 4．室溫干燥約2min.，同時制備測試溶液。 5．在2ml封閉液中加入1μl Anti-DIG-AP。 6．顯色底物溶液：在2ml檢測緩沖液中加入9μl NBT溶液和7μl BCIP溶液。 7．準備5個樣品池（2.5 ~ 5ml容量），1～6順序編號，依次加入2ml以下溶液。 ①. 封閉液； ②. 抗體溶液（第5項）； ③. ③④⑤洗膜緩沖液； ④. 檢測緩沖液； ⑤. 顯色底物溶液（第6項） 8．將樣品測試條和對照測試條按下列順序在上述準備的溶液中浸漬處理，兩步驟直接讓多余的溶液滴在吸水紙上。 ①. 封閉， 2min.→ ②. 抗體結合， 3min.→ ①.? ?封閉， 1min.→ ③． 洗膜, 1min. → ④． 平衡， 1min. → ⑤. 顯色反應（黑暗），5－30min. 9．顯色反應30min.即停止反應（延長顯色反應時間，會增加背景而影響結果比較），用水漂洗測試條，將其置于3mm Whatman濾紙上空氣干燥，然后在光下檢測。 結果評估 顯色反應進行5～10min.時，對照測試條中300pg濃度的樣點即會出現顏色，30min.時3pg的樣點也可見顏色，隨即停止顏色反應。漂洗后比較對照與待測樣品顏色，根據對照濃度與待測樣品的稀釋濃度計算標記物的數量。 如果標記物濃度低于10－30pg則不適宜采用這一快速檢測方法。 方法二、用DIG標記的RNA對照比較檢測 試劑：DIG標記的對照RNA（濃度約為100μg/ml） 其它試劑同方法一 試驗程序 1．將DIG標記的對照RNA先稀釋成20ng/μl（5μl對照RNA加入20μl DEPC-H2O），取5支Eppendorf管以A、B、C、D、E、F順序編號，將對照按下列比例稀釋成一系列濃度： 編號 對照RNA稀釋方法 終濃度 A 20ng/μl RNA 2μl＋RNA稀釋緩沖液38μl? ?1ng/μl B A 5μl＋RNA稀釋緩沖液45μl 100pg/μl C B 5μl＋RNA稀釋緩沖液45μl 10pg/μl D C 5μl＋RNA稀釋緩沖液45μl 1pg/μl E D 5μl＋RNA稀釋緩沖液45μl 0.1pg/μl F E 5μl＋RNA稀釋緩沖液45μl 0.01 pg/μl * 稀釋后的A－E可以在-70℃下至少貯存一年。 2．按照同樣的方法將待測的DIG－RNA也稀釋成一系列濃度，編號用1、2、3、4、5、6以便于與對照區別。 3．取一片尼龍膜，按照前述方法一的方法點樣，第一排點對照，第二排點待測樣，不必從濃度A開始，只需點C－F濃度進行檢測。 4．用UV交聯方法或尼龍膜也可采用120℃烘膜30min.的方法使RNA固定于膜上，再用洗膜緩沖液洗膜幾秒種。 5．將膜置于封閉液中，室溫下封閉30min.。 6．準備抗體溶液：用封閉液按1∶5000的比例稀釋Anti-DIG-AP。 7．將膜置于抗體溶液中，室溫下保持30min.，注意抗體溶液必須沒過膜。 8．室溫下用洗膜緩沖液洗膜2次，每次15min.。 9．再將膜置于檢測緩沖液中2min.。 10．在10ml檢測緩沖液中加入45μl NBT和35μl BCIP配制成顯色底物溶液（現配現用）。 11．除去檢測緩沖液，加入顯色底物溶液，在黑暗下顯色大約16小時（一般幾分鐘即可見開始顯色），注意在顯色過程中，切勿振蕩樣品盤。 12．當顏色沉淀充分后，停止顯色反應，用TE緩沖液或無菌水洗膜5min.。 13．比較對照和樣品的顏色測算濃度。

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