?

1. 實驗目的

??????? 通過實驗了解熒光原位雜交技術的基本原理和在生物學、醫學領域的應用。掌握原位雜交技術的操作方法，熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法。

2. 實驗原理

??????? 熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領域。FISH的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。

??????? 雜交所用的探針大致可以分為三類：1）染色體特異重復序列探針，例如a衛星、衛星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復序列，與靶位結合緊密，雜交信號強，易于檢測；2）全染色體或染色體區域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法。間接標記是采用生物系標記的dUTP(biotin-dUTP)經過缺口平移法進行標記，雜交之后用藕聯的熒光素的抗生物系的抗體進行檢測，同時還可以利用幾輪抗生物素蛋白―熒光素、生物素化的抗―抗生物素蛋白、抗生物素蛋白―熒光素的處理，將熒光信號進行放大，從而可以檢測500bp的片段。而直接標記法是將熒光素直接與探針核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共價結合，或在缺口平移法標記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標記法在檢測時步驟簡單，但由于不能進行信號放大，因此靈敏度不如間接標記的方法。

3. 實驗用具及材料

??????? Y染色體探針、人外周血中期染色體細胞標本、恒溫水浴鍋、培養箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400、熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20。

4. 實驗方法及步驟

1）探針及標本的變性

（1）探針變性

??????? 將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

（2）標本變性

①將制備好的染色體玻片標本于50℃培養箱中烤片2～3h。（經Giemsa染色的標本需預先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片標本，將其浸在70～75℃的體積分數70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。

③立即按順序將標本經體積分數70%、體積分數90%和體積分數100%冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。

2）雜交

??????? 將已變性或預退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態，此過程在濕盒中進行。

3）洗脫

??????? 此步驟有助于除去非特異性結合的探針，從而降低本底。

（1）雜交次日，將標本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2）將已雜交的玻片標本放置于已預熱42～50℃的體積分數50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。

（3）在已預熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。

（4）在室溫下，將玻片標本2×SSC中輕洗一下。

4）雜交信號的放大

（1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

（2）去掉保鮮膜，再加150mL avidin-FITC于標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續溫育40min。

（3）取出標本，將其放入已預熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。

（4）在玻片標本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。

（5）去掉保鮮膜，加150mL antiavidin于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。

（6）取出標本，將其放入已預熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。

（7）重復步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。

（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

5）封片

??????? 可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持數月之久。

6）熒光顯微鏡觀察FISH結果

??????? 先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發光源，FITC的激發波長為490nm。細胞被PI染成紅色，而經FITC標記的探針的探針所在位置發出綠色熒光。由于本實驗使用的是Y染色體上的特異序列，因此在男性外周血染色體標本的雜交中呈陽性，即使在末分裂的細胞中，也可以觀察到明顯的雜交信號。照相記錄實驗結果（圖16-1）。

附錄I?? FISH相關溶液的配制

1）20×SSC：175.3g NaCl, 882.g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L NaOH調pH至7.0）。

2）去離子甲酰胺（DF）：將10g混合床離子交換樹脂加入100mL甲酰胺中。電磁攪拌30min，用Whatmanl號濾紙過濾。

3）體積分數70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。

4）體積分數50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。

5）體積分數50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

6）雜交液：8mL體積分數25%DS， 20mL 20×SSC混合。（或40mL體積分數50%DS，20mL 20×SSC，40mL ddH2O混合）取上述混合液50mL，與5mL DF混合即成。其終濃度為體積分數10% DS 2×SSC，體積分數50% DF。

7） PI/antifade溶液

??????? PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100mg/mL，取出1mL，加39mL雙蒸水，使終濃度為2.5mg /mL。

??????? Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3調pH值為8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混勻。

??????? PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1：9比例充分混勻，-20℃保存備用。

8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300,以antifade溶液稀釋成工作液。

9）封閉液I：體積分數5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL混合。

10）封閉液II：體積分數5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL混合。

11）熒光檢測試劑稀釋液：體積分數5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL混合。

12）洗脫液：100mL 20×SSC，加水于500mL，加Tween20 500 mL。

13）TE緩沖液：pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

????????????? pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

????????????? pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA。

14）溶液I：25mmol/L Tris HCl(pH 7.4), 10mmol/L EDTA。

15）溶液II：10% SDS，0.2M NaOH。

16）溶液III：Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至50mL。

17）LB培養基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g, 加水至1000mL，用5mmol/L NaOH調pH值至7.0。

附錄II? DNA探針的制備

質粒DNA克隆的提取、純化和鑒定。

1）用接種環挑取一小塊-70℃凍存的轉化菌，接種于5mL LB培養基中，37℃劇烈震蕩過夜。

2）將收集到的菌液3000r/min離心10min，棄掉上清液。

3）向菌體沉淀中加入溶液I300mL, 溶液II 350mL，混勻后將其置于冰浴中片刻，再加溶液III 350mL混勻，加酚和氯仿混合液（體積比為1：1）500mL 后充分混勻。

4）12000r/min離心10min。

5）取上清液，向其加入600mL異丙醇，充分混勻后以12000r/min離心15～30min，棄掉上清液。

6）用1500mL體積分數70%乙醇洗滌沉淀2～3次，晾干。

7）用TE緩沖液溶解DNA沉淀。

8）加水至200mL，以Rnase A（終濃度200mg /mL）在50℃水浴中消化30min。

9）加入酚、氯仿和異丙醇（三者體積比25：24：1）溶液200mL混勻，12000r/min離心2min。

10）取上清液，再加入氯仿和異戊醇溶液（體積比為24：1）200mL混勻，12000r/min離心2min。

11）取上清液，以20mL 3M NaAc及500mL體積分數100%乙醇沉淀DNA。

12）可將上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA，然后用12000r/min離心15min。

13）將沉淀用1.5mL體積分數70%乙醇輕洗，自然晾干。

14）用TE緩沖液溶解DNA。

15）取1～2mL上述純化的DNA溶液，于8.0g/L瓊脂糖/TBE緩沖液凝膠電泳鑒定DNA并檢測濃度。

16）取1mg DNA，用相應限制性內切酶4～5單位，BSA100～200mg /mL，于37℃水浴中酶解2～4h。

17）電泳觀察，根據酶切片段數量及大小，估計DNA克隆插入片段大小。

附錄III?? 探針的生物素標記

??????? 探針的標記可采用PCR或缺口平移法來制備，但多數情況下采用缺口平移法來制備。該過程包括以DNase I在DNA雙鏈上作用產生缺口并以此作為第二反應步驟的作用赳噗，即大腸桿菌聚合酶I自缺口處進行修補合成。在修補合成互補鏈時將生物素標記的d-NTP摻入，從而復制出帶有生物素標記的探針。本實驗采用缺口平移法，按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP標記探針。標記好的探針可以在-20℃下長期保存。

總反映體積50mL， DNA 1mg,10×dNTP 5mL, 10×Enzyme Mix 5mL。

其中10×dNTP為：500mmol/L Tris?HCl(pH 7.8)

50mmol/L MgCl2

100mmol/Lβ-硫基乙醇

100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白

0.2mmol/L dCTP, 0.2mmol/L dGTP, 0.2mmol/L dTTP

0.1mmol/L dATP, 0.1mmol/L biotin-14-dATP

10×酶混合為：0.5units/mL DNA聚合酶I

????????????? 0.075untis/mL Dnase I

????????????? 50mmol/L Tris?HCl(pH 7.5)

????????????? 5mmol/L醋酸鎂

????????????? 1mmol/L β-硫基乙醇

????????????? 0.1mmol/L苯甲基磺酰氟

????????????? 體積分數50%甘油

????????????? 100mg /mL牛血清白蛋白

??????? 將上述混合液于16℃作用1h。用8.0g/L瓊脂糖/TBE緩沖液凝膠電檢測標記產物。以DNA片段長約300～500bp為宜。如片段較大，則應加適量Dnase I繼續酶切，直至DNA片段長度適中后，加5mL終止緩沖液（300mmol/L EDTA）終止反應。用乙醇沉淀的方法將探針與非摻入的核苷酸分開。

?