摘要: RNA沉默是廣泛存在于 生物 中的一種古老現象,是 生物 抵抗異常DNA的一種保護機制,同時在生物生長發育過程中扮演著基因表達調控的角色。文章對RNA沉默研究中的幾個熱點問題進行了介紹,按RNA沉默持續時間的不同對其在植物中應用的方法進行了分析,并重點論述了RNA沉默在植物功能基因組研究、作物品質改良以及抗病毒植物培育等方面的應用及其發展前景。 關鍵詞 :RNA沉默;RNA干擾;功能基因組;作物品質改良;抗病毒植物 RNA沉默(RNAsilencing)是一種結合和降解特異mRNA序列的形式,其發現可追溯到1990年,Napoli等[1]向矮牽牛中導入更多拷貝與粉紅色色素合成有關的基因以產生顏色更深的紫色矮牽牛花,結果許多花朵的顏色不但沒有加深,反而變成白色或花白色。因為導入的基因和其同源的內源基因同時都被抑制,所以被稱為共抑制(co-suppression)現象。另外,這種共抑制現象被確認是發生在轉錄后水平,所以又被稱為轉錄后基因沉默(post-transcrip-tionalgenesilencing,PTGS)。隨后發現在真菌中的消除(quelling)現象以及動物的RNA干擾(RNAinterference,RNAi)現象都屬于RNA沉默。另外,Makarova等[2]在最近的研究發現,在原核生物中同樣存在著類似真核生物的RNA沉默機制。 『生物秀實驗頻道 www.bbioo.com』 RNA沉默自發現以來,迅速的成為生物學研究的熱點。不論對其機制的研究還是作為一種基因表達抑制技術的應用,RNA沉默都取得了巨大的成功。本文簡要介紹了RNA沉默的產生機制及植物RNA沉默的特異性、RNA沉默的技術特點及其與RNA介導的DNA甲基化的關系等研究熱點,并系統論述了RNA沉默技術在植物中的應用。本文還對RNA沉默技術的操作技術和應用領域進行了闡述,并對RNA沉默的在植物中的應用前景進行了展望。 1 RNA沉默研究中的幾個熱點問題 1.1RNA沉默的產生及其基本機制 RNA沉默是存在于生物中的一種古老現象,是生物抵抗異常DNA(病毒、轉座因子和某些高重復的基因組序列)的保護機制,同時在生物發育過程中扮演著基因表達調控的角色,它可以通過降解RNA、抑制翻譯或修飾染色體等方式發揮作用[3]。RNA沉默存在兩種既有聯系又有區別的途徑:siRNA(smallinterferenceRNA)途徑和miRNA(microRNA)途徑。siRNA途徑是由dsRNA(double-strandedRNA)引發的,dsRNA被一種RNaseⅢ家族的內切核酸酶(RNA-inducedsilencingcomplex,Dicer)切割成21~26nt長的siRNA,通過siRNA指導形成RISC蛋白復合物(RNA-inducedsilencingcomplex)降解與siRNA序列互補的mRNA而引發RNA沉默。而miRNA途徑中miRNA是含量豐富的不編碼小RNA(21~24個核苷酸),由Dicer酶切割內源性表達的短發夾結構RNA(hairpinRNA,hpRNA)形成。miRNA同樣可以與蛋白因子形成RISC蛋白復合物,可以結合并切割特異的mRNA而引發RNA沉默[4]。盡管引發沉默的來源不同,但siRNA和miRNA都參與構成結構相似的RISC,在作用方式上二者有很大的相似性。 1.2RNA沉默在植物與其他生物中的差異 盡管不同生物的RNA沉默機制相似,但植物與其他生物相比有其特異性。首先,在植物中存在系統性沉默(systematicRNAsilencing)現象,RNA沉默不會局限于單個細胞內,可以在細胞與細胞之間、甚至由誘導部位向更遠的組織傳播。其次,植物中存在轉移性沉默(transitiveRNAi),對于轉基因植物中的外源基因,如果dsRNA誘導的RNA沉默區域對應于基因的中間區域,能檢測到與其側翼區段對應的siRNA。但內源基因卻缺乏轉移性沉默,表現出沉默區域的保守性[5,6]。這兩種現象在線蟲中也有發現,但在哺乳動物和昆蟲中卻沒有發現類似的現象。最后,植物中的RNA沉默跟兩種不同大小的siRNA有關:21nt和24ntsiRNA,21nt由RISC指導切割目的mRNA,而24nt則引發了系統性沉默和甲基化;而在動物中僅發現21nt的siRNA。 1.3RNA沉默與其他基因表達抑制技術的比較 RNA沉默屬于一種基因表達抑制技術,能夠使基因的表達受到抑制甚至完全不表達。基因表達抑制技術從作用機理上可分為DNA水平上的抑制(基因打靶、轉座子標簽和T-DNA插入等)、轉錄水平上的抑制(調控區甲基化等)和轉錄后水平上的抑制(反義RNA和RNA沉默等),在基因功能研究中,RNA沉默與其他幾種基因表達抑制技術相比有明顯的優越性。首先,它比反義RNA技術效率更高,能在低于反義RNA幾個數量級的濃度下使目標基因表達降到極低的水平甚至完全“剔除”,因此更容易產生功能降低甚至缺失的突變;其次,與T-DNA和轉座子標簽技術相比,不存在插入位點隨機性的問題,理論上任何基因都可被針對性的dsRNA特異性沉默;最后,應用同源重組進行的基因敲除效率非常低,且打靶載體構建所需的同源序列較長,而RNA沉默高效并且需要的同源序列則較短。Wesley等[7]利用hpRNA載體產生的RNA沉默,98bp長的同源序列即可產生有效地RNA沉默。