孫德惠 才學鵬 常惠蕓 獨軍政 （1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原 生物 學國家重點實驗室農業部畜禽病毒學重點開放實驗室，甘肅蘭州 730046；2.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州 730070） 摘 要 ：RNA 干擾(RNA interference,RNAi)是一種由雙鏈RNA介導的基因沉默現象。RNAi主要發生在核外，RNAi具有操作簡便快速等特點。RNAi現象自發現至今已逾10年，在此期間，已將研究重點由機理研究轉向應用研究。文章以RNAi的應用為重點，從RNAi的起源、可能的作用機制、作用特點、研究方法、應用前景及展望等方面進行了綜述。 關鍵詞 ：RNA干擾；雙鏈RNA;基因沉默 RNAi是Napoli C D等[1]在試圖向紫色矮牽牛花轉導色素合成基因,用以增加其花色時發現的。結果出乎預料,轉基因的植株不僅沒有新基因的表達,反而自身的色素合成也減弱了,一些轉基因的花出現了全白色或部分白色。他們把這種導入的基因未表達和植物本身合成色素基因的失活現象命名為共抑制(cosuppression)。之后,Ramano等在向粗糙孢菌(Neurospora crassa)中導入合成胡蘿卜素的基因時造成失活,他們稱為基因靜止(quelling)。Guo S等[2]發現正義RNA與反義RNA有相同水平的抑制效應，但未能就此現象給出合理的解釋。Fire A等[3]在研究反義核苷酸時發現在線蟲體內,雙鏈RNA( double stranded RNA,dsRNA)能有效地抑制有互補序列的內源性基因,且抑制效果優于單鏈反義RNA。至此，正式提出了雙鏈RNA誘導的RNAi的概念，開啟了RNAi研究的序幕。 1 RNAi可能的作用機制及特點 1.1 RNAi的作用機制 雖然RNAi作用的確切機制尚不清楚，但目前普遍認可是Bass假說。具體概括為三個階段。 （1）起始階段。在細胞內,雙鏈RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ) Dicer 在ATP的參與下被處理為21個～23個堿基的小RNA，即小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA是由19個～21個堿基配對形成的雙鏈,并在其3′末端有兩個游離未配對的核苷酸。研究發現, siRNA 是RNAi 作用發生的重要中間分子，序列與所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性；雙鏈的兩端各有2個～3個突出的非配對的3′堿基；兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基。這些是細胞賴以區分真正的siRNA和其他雙鏈RNA的結構基礎。 研究表明,平末端的siRNA 或失去了5′磷酸基團的siRNA 不具有RNAi 的功能[4] （2）引發階段。siRNA與Argonaute蛋白家族及其他未知因素結合，形成siRNA-核蛋白復合物（siRNA-ribonucleoprotein complex，siRNP）。siRNP在ATP及其他未知因素參與下，使雙鏈siRNA解旋形成RNA誘導的沉默復合物(RNA inducing silencing Complex ,RISC)。RISC可能以完全單鏈或兩條鏈解旋但不完全分離的形式存在，繼而RISC在dsRNA的介導作用下與互補mRNA結合，并將其降解。mRNA被降解在轉錄后水平,抑制基因表達,因而又稱之為轉錄后基因沉默( posttranscriptional gene silencing,PTGS) （3）循環放大階段。在siRNA誘導的RNAi過程中,可能還存在siRNA 的循環放大過程,以維持它的RNA誘導功能。此過程推測是以siRNA為引物,互補mRNA 為模板,在RNA依賴性RNA合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase,RdRP) 的作用下,合成新的雙鏈RNA，再由Dicer作用,產生新的siRNA,完成siRNA 的放大過程，開始新的RNAi循環[5]。 關于對RNAi機制中重要酶的作用研究，Zamore P D等[6]發現，21 nt RNA指導mRNA的降解； Scharf W D等[7]發現ATP依賴的RNA解旋酶為Mut6;Grishok A等[8]發現Let-7和lin-4為內源性的RNAi基因（stRNA）；Dalmay T等[9]提出RNA依賴的RNA多聚酶就是SDE-1； Bernstein E等[10]證實RNaseш樣的核酸酶為Dicer; Elbashir S M等[11]應用外源性21 nt-siRNA能夠抑制同源mRNA的表達;Novina C D等[12]證實無論是針對病毒感染細胞所需的CD4受體，還是針對病毒基因組的gag區域，siRNA都可以有效地使病毒與細胞的基因沉默，抑制HIV的感染與復制。