推薦:RNAi—雙鏈RNA引起的基因敲除
CMBI 評論員 李黔
1995年,康奈爾大學的Su Guo博士用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發現,反義和正義RNA都阻斷了基因的表達,他們對這個結果百思不得其解。直到1998年, Andrew Fire的研究證明,在正義RNA也阻斷了基因表達的試驗中,真正起作用的是雙鏈RNA[1]。這些雙鏈RNA是體外轉錄正義RNA時生成的。這種雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干預(RNA interference,RNAi)。隨后的研究中發現,RNAi現象廣泛存在于線蟲,果蠅,斑馬魚,真菌以及植物等 生物 體內,這些 生物 體利用RNAi來抵御病毒的感染,阻斷轉座子的作用。RNAi能高效特異的阻斷基因的表達,在線蟲,果蠅體內,RNAi能達到基因敲除的效果。在小鼠和人的體外培養細胞中利用RNAi技術也成功阻斷了基因的表達,實現了細胞水平的基因敲除。近幾年來RNAi的研究取得了很大進展,它被《Science》雜志評為2001年的十大科學成就之一。2002年RNAi的研究又有了新的突破,發現它在基因表達調控中發揮重要作用,它也名列2002年《Science》雜志評的十大科學成就之首。
一. RNAi的機理
目前RNAi的作用機理主要是在線蟲,果蠅,斑馬魚等生物體內闡明的。生物體內的雙鏈RNA可來自于RNA病毒感染,轉座子的轉錄產物,外源導入的基因。這些來源的雙鏈RNA誘發了細胞內的RNAi機制,結果是病毒被清除,轉座子的表達被阻斷,外源導入基因表達被阻斷同時,與其同源的細胞基因組中的基因表達也被阻斷。
㈠ 參與RNAi反應的酶
RNA酶Ⅲ是一種能切割雙鏈RNA的酶,參與RNAi反應的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一個成員。Dicer酶廣泛存在于蠕蟲,果蠅,真菌,植物及哺乳動物體內。它的結構中包括一個螺旋酶結構域,兩個RNA酶Ⅲ結構域,一個雙鏈RNA結合位點。在Dicer酶的作用下,雙鏈RNA被裂解成21到23個核苷酸的片斷,稱為siRNA(short interference RNA)[2],它啟動了細胞內的RNAi反應。
由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達,并且這種效應可以傳遞到子代細胞中,研究者們推測細胞內存在RNAi效應的擴增系統。研究者們發現,在真核細胞中也存在能以RNA為模板指導RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase,RdRP)。在RdRP的作用下,進入細胞內的雙鏈RNA通過類似于PCR的反應過程,呈指數級的數量擴增。
㈡ RNAi的反應過程
雙鏈RNA進入細胞后,一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA,另一方面在RdRP的作用下自身擴增后,再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開變成單鏈,并和某些蛋白形成復合物,Argonaute2是目前唯一已知的參與復合物形成的蛋白[3]。此復合物同與siRNA互補的mRNA結合,一方面使mRNA被RNA酶裂解,另一方面以SiRNA作為引物,以mRNA為模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈[4,5]。結果mRNA也變成了雙鏈RNA,它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發RNAi的作用,通過這個聚合酶鏈式反應,細胞內的siRNA大大增加,顯著增加了對基因表達的抑制。從21到23個核苷酸的siRNA到幾百個核苷酸的雙鏈RNA都能誘發RNAi,但長的雙鏈RNA阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA。
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