1.Total RNA isolation： 測定OD 260 ，OD 280 及兩者比值，換算出RNA的濃度。并電泳鑒定。 2.Gel： 以80ml的1.5％甲醛瓊脂糖凝膠為例： agrose：1.2g dd H 2 O：57.6ml 10×RNB*(RNA buffer)：8ml（RNB具體配方見后，用*表示，下同） 甲醛溶液：14.4ml 3. Electrophoresis： （1）加樣：（以取20μg RNA為例）在0.5ml管中加20 μg RNA＋2－4倍RNA體積的SB溶液* ，votex，65℃熱變性10min，立即上冰5min，微離心一下，加相應的10×loading buffer（大連寶 生物 公司taq酶系列會提供），混勻，準備上樣。 （2）預電泳：在正式上樣電泳前，在膠點樣孔中各加一點10×loading buffer（加的孔數要超過正式電泳所用的點樣孔）先看點樣孔漏不漏，預電泳15－20min。此工作可在RNA變性時進行。這一方面可判斷膠漏不漏，另一方面可使膠活化。 （3）正式電泳：將（1）步的混勻樣全部加入點樣孔，50V電泳4－5小時（電泳時間長短還要依你膠的大小而定，一般要使loading buffer跑到四分之三左右。 電泳最好在4℃冰箱里進行，并且要有循環器在電泳緩沖液兩邊進行交換，以防兩端緩沖液PH相差過大。電泳緩沖液用1×RNB。 4.轉膜： （1）在轉移槽內放好玻璃板，鋪好濾紙橋，緊貼玻板。 （2）倒入轉移液（20×SSC*），浸透濾紙橋，驅除氣泡，同時按膠大小剪好合適的膜（膜為Amersham公司的Hybond－N＋膜）和兩張同樣大小的濾紙。 （3）將膠從加樣孔先接觸濾橋面，自一端將膠滑放至濾紙橋上，注意不留氣泡。 （4）將膜放在膠上，小心慢速，自一端起緊貼膠面，檢查及排除氣泡，用一干凈玻棒輕緩的在膜上滾幾下以排除氣泡。 （5）用保鮮膜在四周封邊，在尼龍膜上放上兩張濾紙片，再堆上5－8cm吸水紙堆，壓上重物，10－24hr。 （6）轉膜完畢，移去吸水紙，將膜取出，紫外交聯（245nm1.5J/cm2照射膜1min45s）并標好膜的正面及加樣順序，將膜在6×SSC或2×SSC溶液中浸泡一下，純水沖洗一下。 （7）用亞甲基藍溶液浸泡搖晃染色3－5min，純水搖床脫色，可見RNA電泳條帶，標好28S，18S。 5.探針的標記：（下列物質除α- 32 P dATP購自Amersham公司，其余來自于Promega公司的labeling kit） （1） 取25－40ng的模板DNA（假設以1μL為例）于0.5ml管中，加11μL dd H 2 O,100℃變性5－10min，立即上冰5min。 （2） 在冰上依次在管中加入： BSA: 1μL dNTP(-dATP):1μL labeling 5×buffer: 5μL klenow酶：1μL（5U/μL） α- 32 P dATP(最后加) 5μL （合計：25μL體系） 振蕩后放入鉛盒，37℃ 1hr，加200μL dd H 2 O終止反應。可4℃短暫保存。 6.探針的純化（sephades G－50柱層析法）： （1）1ml注射器底部用無菌玻璃棉填塞，加剪蓋的0.5ml管放入體積較大的 離心管 中，注射器中裝填用ＳＴＥ平衡的sephades G－50凝膠。 （2）層析柱室溫離心，1000g×2min，再重復步驟（1）（2），使注射器裝滿sephades G－50凝膠。 （3）將標記好的探針滴加在層析柱上，離心，1000g×4min，收集0.5ml管中液體，即為純化好的標記cDNA探針。