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用于檢測植物組織 RNA 的原位雜交法

（一）組織切片制備

l ???? 植物組織的甲醛固定和包埋

1．將植物組織切成小塊，立即放入一個裝有10～50ml固定劑溶液的燒杯中，把燒杯放到真空脫水機內。調節真空度以形成一個溫和的真空，然后慢慢恢復常壓。微量便于固定劑滲入組織，必須反復真空和非真空狀態。待固定劑充分滲入組織塊后，室溫下放置2～3小時。

2．室溫下用50～100ml 50mmol/L PIPES緩沖液（pH6.8）漂洗組織塊20分鐘。

3．室溫下將組織塊先后放在不同稀釋度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和100％）中脫水。每個梯度取50～100ml，各培養20分鐘。4℃下用50～100ml 100％乙醇培育組織塊，脫水過夜。溫和的搖動或攪動可以促進組織中溶劑的交換。

4．第二天上午，將組織塊轉移到50～100ml新的100％乙醇中。再脫水30分鐘。

5．室溫下用不同稀釋度的二甲苯乙醇溶液（25％，50％，75％和100％）先后浸滲組織塊。每個梯度取用50～100ml，各培育60分鐘。在100％二甲苯中重復培育2次。

6．在60℃下用不同稀釋度的Paraplast PlusTM 二甲苯溶液（25％，50％，75％和100％）先后浸滲組織塊。每個梯度取用50～100ml，各浸滲2小時。60℃下用100％Paraplast PlusTM 溫育組織塊，浸滲過夜。在60℃溫育過程中，我們發現水浴加熱比在電爐上直接加熱更能維持一個穩定的溫度。水浴加熱時，必須將放置組織塊的燒杯嚴密封口以防止水汽滲入正在包埋的介質中。

7．至此，組織塊可以包埋在Paraplast PlusTM 塊中了。為了制備包埋塊，首先將機械模具放在載片加熱儀上，溫度設置在60℃。避免過分加熱。在模具中倒入熔化的Paraplast PlusTM ，將組織塊轉移到模具內。用一根細菌接種針安排好它們的位置，然后加入更多熔化了的Paraplast PlusTM 。在模具中插入合適的附架。為了確保Paraplast PlusTM 冷卻后附架的穩固性，可以再添加一些熔化的Paraplast PlusTM 。將模具轉移到實驗臺上使其慢慢冷卻。在切片前包埋塊可以保存在模具中。

8．從模具中取出包埋塊之前，將模具緊緊貼在冰上，使金屬模具收縮5～10秒。然后用刮刀將蠟塊撬出。

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l???? 顯微鏡載玻片的準備

1．把所需數量的顯微鏡載玻片放入一個載玻片固定器，浸入ChromergeTM ，室溫下過夜。

2．從ChromergeTM 中取出載玻片，在流水中洗滌3小時。然后用蒸餾水沖洗，鋁箔包裹后180℃烘烤過夜。

3．包被。把載玻片浸入含2％TESPA的丙酮溶液5～10秒。迅速用丙酮洗滌兩次，再用蒸餾水沖洗一次，然后空氣干燥。用TESPA包被后載玻片可以保存幾個月。

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l???? 植物組織的封固和切片

1．在一個耐熱玻璃盤中倒入大約1L的組織切片粘合劑，放入45℃水浴加熱。

2．用一個鋒利的單邊剃刀，修去包埋組織邊緣多余的蠟。切痕應該呈長方形，表面光潔。修去由模具產生的圓形邊緣。確保包埋塊上下邊緣平行。修塊時將包埋塊鎖定在切片機的卡盤中，使修整過的平行邊緣位于包埋塊的頂部和底部。

3．從包埋塊上切下一條切片條，每個切片的厚度約為8～10μm。用濕潤的指尖和小畫刷將切片（光亮面向下）轉移到耐熱玻璃盤的組織粘合劑中。切片在溶液中漂浮2～3分鐘后，用載玻片提起。在磨砂邊緣處拿著載玻片，以近垂直的角度浸入溶液中。使切片條中兩個切片結合處與載玻片的邊緣相平。載玻片輕輕向切片移動，碰到切片后溫和提起。經過一些操作實踐比較有經驗后，提起載玻片時可以將一個單獨的切片從切片條中分離出來。從切片條中分離和提起單個切片時，用畫刷保持切片條的穩定。如果要在載玻片上調整切片的位置，可以將載玻片再次浸入粘合劑中，重新漂浮切片，仍以近垂直的角度拿著載玻片，對著載玻片用畫刷放置好切片，然后從粘合劑中溫和地提起載玻片。

4．在溫育箱中，將載玻片豎立，42℃干燥過夜。

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（二）RNA 探針的合成

l???? 制備線狀的DNA 模板

1．選用合適的限制性內切酶（50～100 units），酶解10～20μg質粒。反應液的總體積約為200μl，37℃保溫2小時。

2．在質粒的酶解液中加入等體積（200μl）的苯酚/氯仿（1：1），抽提線狀DNA。溫和地漩渦振蕩試管，混勻。離心分層，將上層的水相轉移到一個干凈的試管中，進行第二次苯酚/氯仿抽提。

3．取出水相，用等體積的氯仿抽提兩次。

4．沉淀DNA片段。加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和2倍體積冰冷的100％乙醇，－20℃下放置1小時。12 000g離心10分鐘。

5．將DNA重新溶解于Tris/EDTA（pH7.6），調節溶液量使DNA的終濃度約為1.0μg/μl。

6．測量260nm和280nm處的光吸收值，確定DNA濃度。一個OD260 單位對應約40μg/μl的雙鏈DNA，OD260 /OD280 的值應為1.8左右。

7．取0.5μgDNA，在小型電泳槽上進行電泳，檢查酶解是否完全。

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l???? DNA 模板的轉錄－生成高度專一活性的RNA 探針

1．配制下列反應溶液：

H2 O????????????????????????????????????? 4μl

轉錄緩沖液（5×）???????????????????????? 5μl

DTT（0.1 mol/L）???????????????????????? 2.5μl

RNA酶抑制劑?????????????????????????? 1.25μl

ATP（10mmol/L）??????????????????????? 1.25μl

CTP（10mmol/L）??????????????????????? 1.25μl

GTP（10mmol/L）??????????????????????? 1.25μl

UTP（500μlmol/L）???????????????????????? 1μl

DNA模板（1μg/μl）????????????????????? 2.5μl

35 S－UTP（1200Ci/mmol）??????????????????? 5μl

總體積??????????????????????????????????? 25μl

為了避免亞精胺引起引起DNA沉淀，應在室溫下添加各種試劑（聚合酶除外，見步驟3）

2．從反應溶液中取出1μl，加入1ml H2 O中。將此樣品標記為t0 ，保存在冰中備用。后面將用它計算RNA探針的合成量。

3．在反應溶液中加入1μl聚合酶T7或SP6，總體積為25μl。40℃溫育45分鐘。

4．從反應溶液中取出1μl，加入1ml H2 O中。將此樣品標記為t45 ，保存在冰中備用。后面將用它來計算RNA探針的合成量。

5．在剩下的反應溶液中（24μl），按1μg DNA模板一個單位的比例加入無RNA酶活性的DNA酶。37℃溫育10分鐘。

6．加入2μl濃度為10μg/μl的tRNA載體。用苯酚/氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次。

7．加入3mol/L 的乙酸鈉（pH6.0）至終濃度為0.3mol/L，再加入2倍體積預先冰浴的100％乙醇，沉淀RNA。－20℃下放置1小時。

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l???? RNA 合成量的計算

1．取4個DE-81濾器，其中兩個分別加上10μl t0 樣品和t45 樣品，作為一組；對另外兩個進行同樣的處理。取一組濾器，用500mmol/L Na2 PO4 （pH7.4）洗4此，每次5分鐘；再用蒸餾水洗滌兩次，每次5分鐘；最后用95％乙醇洗。每一次洗滌大約消耗200ml洗滌液。將洗過的濾器干燥。用3 H＋14 C頻道對所有濾器進行計數。

2．未洗的濾器代表每個樣品中35 S的總數，洗滌的濾器則表示摻入RNA的35 S的數目。經過45分鐘的反應，應該有大約70％的35 S摻入RNA。

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用于檢測植物組織 RNA 的原位雜交法

（一）組織切片制備

l????? 植物組織的甲醛固定和包埋

1．將植物組織切成小塊，立即放入一個裝有10～50ml固定劑溶液的燒杯中，把燒杯放到真空脫水機內。調節真空度以形成一個溫和的真空，然后慢慢恢復常壓。微量便于固定劑滲入組織，必須反復真空和非真空狀態。待固定劑充分滲入組織塊后，室溫下放置2～3小時。

2．室溫下用50～100ml 50mmol/L PIPES緩沖液（pH6.8）漂洗組織塊20分鐘。

3．室溫下將組織塊先后放在不同稀釋度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和100％）中脫水。每個梯度取50～100ml，各培養20分鐘。4℃下用50～100ml 100％乙醇培育組織塊，脫水過夜。溫和的搖動或攪動可以促進組織中溶劑的交換。

4．第二天上午，將組織塊轉移到50～100ml新的100％乙醇中。再脫水30分鐘。

5．室溫下用不同稀釋度的二甲苯乙醇溶液（25％，50％，75％和100％）先后浸滲組織塊。每個梯度取用50～100ml，各培育60分鐘。在100％二甲苯中重復培育2次。

6．在60℃下用不同稀釋度的Paraplast PlusTM 二甲苯溶液（25％，50％，

l????? RNA 剪切

1．12 000g離心10分鐘沉淀RNA，去上清。用200～300μl 70％的乙醇洗RNA沉淀一次。待殘留的微量乙醇揮發后，將RNA沉淀重新懸浮于50μl無RNA酶（經DEPC處理）的H2 O。

2．RNA必須剪切成約150～200bp的合適長度。RNA剪切所需的最佳時間可以通過下式計算（Cox et al. 1984）：t＝（L0 －Lf ）/（KL0 Lf ）

此處L0 是RNA的初始長度（單位：kb），即轉錄起始位點到所選用的限制性內切酶的切割位點之間的距離；Lf 是RNA的最終長度（單位：kb）；K為0.11。時間的計算以分鐘為單位。

2．在50μl RNA懸浮液中加入30μl 0.2mol/L Na2 CO3 和20μl 0.2mol/L NaHCO3 ，混勻。在60℃下溫育t分鐘。

3．加入3μl 3mol/L乙酸鈉（pH6.0）和5μl 10％冰乙酸，終止反應。

4．加入3mol/L乙酸鈉（pH6.0）至終濃度為0.3mol/L，再加入2倍體積冰冷的100％乙醇，沉淀RNA。－20℃保溫1小時。

5．12 000g離心10分鐘。用70％乙醇洗RNA沉淀。將RNA重新懸浮適量4×雜交儲備液B中。通常用25μl雜交儲備液B較合適。

雜交儲備液B（4×）（10ml）：

DTT???????????????????????????? 216mg

poly A???????????????????????????? 20mg

tRNA?????????????????????????? ????6mg

6．取1μl樣品，測定重新獲得的RNA量。

7．走甲醛膠，測定剪切后RNA的大小。

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（三）組織的預雜交處理

1．用100％的二甲苯洗載玻片2次，約10分鐘，把Paraplast PlusTM 從封固好的組織切片中洗去。然后將載玻片轉移到100％乙醇中，反復浸泡、洗滌，直至載玻片上所有的條痕消失。

2．在室溫下，依次用不同稀釋度的乙醇水溶液（95％，75％，50％和25％）洗滌載玻片，使之重新水化。每一次都要將載玻片在乙醇溶液中反復浸泡，直至載玻片上所有的條痕消失。用水洗載玻片2次。將用過的乙醇/水溶液保存起來備用。

3．將載玻片在蛋白酶K溶液中37℃溫育30分鐘。用水洗載玻片2次。

4．為了減少RNA探針的非特異性結合，必須將組織中或玻璃片上殘存的任何正電荷乙酰化。室溫下，將載玻片置于約100ml 0.1mol/L三乙醇胺溶液（pH8.0）中平衡5分鐘。傾去三乙醇胺溶液，立即加入約100ml新配制的0.25％乙酸酐溶液。室溫下溫育10分鐘。

5．用2×SSC洗滌載玻片。將載玻片浸入溶液，再提出液面，如此反復15分鐘。

6．在室溫下，依次用不同稀釋度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和95％）洗滌載玻片，使組織切片脫水。然后用新的100％乙醇洗載玻片2次。每一次洗滌都應洗至載玻片上所有的條痕消失。

7．干燥組織切片。在真空下約1小時，在常溫常壓下要幾個小時。

8．檢查組織切片的完整性。給載玻片編號，用于組織類型、雜交探針的快速鑒定，等等。載玻片的磨砂端很容易用軟芯鉛筆作標記。標號的方式應便于雜交實驗的進行。

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（四）雜交

1．計算處理載玻片所需要的雜交緩沖液的量。將一定量的RNA探針加入適量的4×雜交貯液B，80℃溫育5分鐘，然后放至冰上快速冷卻，得到變性的RNA探針。

雜交儲備液B（4×）（10ml）：

DTT???????????????????????????? 216mg

poly A???????????????????????????? 20mg

tRNA?????????????????????????????? 6mg

2．取等量的4×雜交貯液A和含變性RNA探針的4×雜交貯液B混合均勻。

雜交貯液A（4×）（10ml）

5 mol/L NaCl??????????????????????????? 2.4ml

1 mol/L Tris-HCl(pH7.5)????????????????? ?0.4ml

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)??????????????????? 0.1ml

100×Denhardt’s溶液??????????????????????? 0.4ml

DTT???????????????????????????????????? 216mg

硫酸葡聚糖???????????????????????????????? 4g

3．加入相當于4×雜交貯液A和B總體積的100％去離子的甲酰胺。再加入RNA酶抑制劑至終濃度為25單位/毫升。將雜交緩沖液置冰浴保存備用。

4．檢查載玻片的編號是否正確，以免加雜交緩沖液時發生混淆。

5．37℃下加熱雜交緩沖液2分鐘。在每一個切片上加25μl溫熱的雜交緩沖液，再蓋上經硅烷化的蓋玻片。避免氣泡產生！

6．將載玻片放入盤中，用濕紙巾或海綿覆蓋，防止溶劑蒸發。42℃溫育過夜。

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（五）雜交后洗滌

1．在一個載玻片盤中加滿含5 mmol/L DTT的4×SSC溶液。將與雜交緩沖液溫育過夜的載玻片轉移到一個載玻片固定器上，置于此載玻片盤中。幾分鐘后，蓋玻片與載玻片之間的結合變得松散。提起載玻片時，蓋玻片會輕輕地脫落下來。

2．蓋玻片脫落下來后，將載玻片轉移到含有含5 mmol/L DTT的4×SSC溶液中，室溫下洗30分鐘。用新鮮的溶液重復洗滌。

3．將載玻片放入含50μg/ml RNA酶A的RNA緩沖液中，37℃下溫育3分鐘。

4．37℃下，用約100ml含5mmol/L DTT的RNA酶緩沖液洗載玻片20分鐘，除去RNA酶A。重復洗滌2次。

5．不嚴格洗滌。將載玻片置于500ml含5mmol/L DTT的2×SSC溶液中，室溫下攪動30分鐘。用新鮮溶液重復洗滌1次。

6．嚴格洗滌。將載玻片置于500ml含1mmol/L DTT的0.1×SSC溶液中，57℃下攪動30分鐘。用新鮮溶液重復洗滌1次。

7．在室溫下，依次用不同稀釋度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和95％）洗滌載玻片，使組織切片脫水。然后用100％乙醇洗載玻片2次。每一次洗滌都應洗至載玻片上所有條痕消失。

8．室溫下，將組織切片真空干燥，約1小時。

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（六）放射自顯影

1．在完全黑暗或安全光照下，將放射自顯影感光乳劑在45℃下熔化。此過程大約需要1～1.5小時。感光乳劑熔化后，用經過45℃預平衡的水按1：1的比例稀釋。

2．將載玻片浸入感光乳劑中。為了避免出現條紋，浸入時動作要緩慢，并且一次性完成。把載玻片豎著放置在一個合適的架子上，室溫下于黑暗中放置1小時，使之干燥。

3．將載玻片放入暗盒中，4℃下適度曝光。

4．曝光1～2天后，將載玻片顯影。在15～20℃下，把載玻片浸入X光片顯影液中，片刻后再提出液面，如此反復5次。使載玻片在顯影液中的全部時間約為2.5分鐘。過度顯影可能會提高背景。

5．從顯影液中取出載玻片，輕輕甩干（1～2秒即可）。

6．把載玻片浸入水中，再提出液面，如此大約30秒鐘。

7．從水中取出載玻片，輕輕甩干。

8．在15～20℃下，把載玻片浸入X光片定影液中，片刻后再提出液面，如此反復5次。使載玻片在定影液中的全部時間約為5分鐘。

9．從定影液中取出載玻片，輕輕甩干。

10．? 將載玻片放入水中，用預冷的流水沖洗30分鐘。然后立即染色。不要等載玻片干燥后再染色。

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（七）染色

1．將載玻片放入0.05％的甲苯胺藍溶液，室溫下溫育約2分鐘。最好先取少量載玻片進行個別染色，以確定最佳的染色時間。因為不同類型的植物組織，染色的時間也不一樣。

2．用水沖洗載玻片2次，約15秒鐘，除去多余的染色液。

3．對染色后的組織切片進行快速脫水。在室溫下，依次用不同稀釋度的異丙醇水溶液（25％，50％，75％）洗滌載玻片。然后用100％異丙醇洗載玻片2次。

4．將載玻片在100％的二甲苯中反復浸蘸，直至所有條痕消失。

5．將載玻片在新鮮的100％二甲苯中浸蘸幾次，然后浸泡在其中。進行下一步操作。

6．將4～5張Kimwipe疊放在一起。從二甲苯中取出一塊載玻片置于其上。快速滴加PermountTM 至載玻片表面。立即把蓋玻片放到載玻片上。重復此操作，直至處理完全部載玻片。將載玻片過夜干燥。

7．在暗場顯微鏡觀察載玻片，使用放大倍數5～20的物鏡。

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