貼壁細胞的脂質體轉染protocol

一、實驗材料 1、宿主細胞CHO（貼壁細胞） 2、脂質體LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司） 3、6孔細胞培養版 4、無血清培養基OPTI-MEM（GIBICO） 5、轉染級質粒 二、實驗步驟 invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000說明書上列舉了24孔、12孔、6孔......板的實驗體系，因為需要轉染的細胞量大，所以一直采用的是6孔版做的轉染。以下是以6孔板為例說明一下我的體系和方法吧！ 1、轉染前一天，以合適的細胞密度接種到6孔培養板上。（我的接種密度是3~4*105/ml.）轉染時，細胞要達到90~95%的融合。 2、溶液1：240ul 無血清培養基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （總體積250 ul）（溫育5min） 3、溶液2：X ul 無血清培養基 + 4 ug 質粒 per well（總體積250 ul） 4、將溶液1與溶液2混合，室溫下置20min。 5、與此同時，將6孔板中的細胞用無血清培養基沖洗細胞兩遍后，加入2ml 無血清培養基。 6、將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻。在37℃，5％的CO2中保溫5~6小時。 7、6小時后，更換含有血清的全培養基，在37℃，5％的CO2中48~72h檢測轉染水平。 8、如果做穩定轉染，換全培養基培養后24h，即可以1：10或更高的稀釋比例（根據細胞的生長情況）接種到新的培養板，加抗生素進行篩選。 三、個人經驗： 我覺得貼壁細胞的脂質體轉染還是很容易的，有了經驗之后，現在做轉染得心應手，轉染前后細胞的形態幾乎不發生變化，幾乎沒有細胞死亡。轉染率很高。以下是個人經驗，與大家分享。 1.細胞的狀態。這點非常重要，不要急于求成，一定要讓細胞處于最佳的生長狀態再做。有文獻說傳代不要超過17代。我總是在細胞復蘇后的3代左右做，那時細胞狀態最好，不要用傳了很多代的細胞去做，細胞的形態都會發生變化了。 2.細胞的融合度。細胞的融合度必須要達到90%才能做，細胞太少，容易死的。 3.無血清培養基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有條件的話，就用它代替PBS洗細胞兩遍（我曾比較過OPTI-MEM與PBS或無血清的DMEM，前者的轉染效率確實高）。注意洗的時候要輕，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細胞，而是轉動培養板讓液體滾動在細胞表面。如果洗的太厲害，細胞又損失一部分，加了脂質體后，細胞受影響就更大了，死亡細胞會增多。 4.加入無血清培養基后5~6小時更換全培養基。無血清培養基培養時間過長，對細胞是有毒性的，這里有血的教訓！ 5.轉染的質粒一定純度好、濃度高、無內毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。低濃度的質粒，我做的結果都不好。 6.48小時mRNA表達最高；72h蛋白表達最高。