放射性標記的探針與固定在膜上的核酸Southern雜交

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放射性標記的探針與固定在膜上的核酸 Southern 雜交

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1. 將含有靶 DNA 的膜漂浮在盛有 6 × SSC （或 6 × SSPE ）的皿中直到膜自下面而上完全浸濕。將膜浸于溶液中 2 min 。

2. 用下列方法之一進行預雜交

在熱密封的袋中進行的雜交

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a.?????? 將膜塞入熱密封袋中（如 Sears Seal-A-Meal 或相應設備），按每平方厘米 0.2ml 加入欲雜交液中。盡量將袋中的空氣擠出。

b.????? 用熱封口機密封袋的開口端兩次。輕輕擠壓袋子以檢測密封的強度及是否完整。將袋子放在適宜溫度的水浴中（水性溶劑雜交液 68 ℃；含有 50% 的甲酰胺的雜交液 42 ℃；磷酸 -SDS 雜交液 65 ℃）

? ? 雜交瓶中進行的雜交

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a.?????? 輕輕的將濕潤的膜卷成圓柱狀與制造商提供的塑料網一起放入雜交瓶。按每平方厘米 0.1ml 加入預雜交液。將瓶蓋擰緊。

b.????? 將雜交管放入預先加熱到適宜溫度的雜交爐中（水性溶劑雜交液 68 ℃；含有 50% 的甲酰胺的雜交液 42 ℃；磷酸 -SDS 雜交液 65 ℃）。

?? 塑料容器中進行的雜交

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a． 將濕潤的膜放在塑料（如 Tupperware ）容器中，按每平方厘米膜 0.2ml 加入預雜交液。

b． 用蓋子密封盒子，將盒子放入預設到適宜溫度的空氣孵箱中的振蕩平臺上（水性溶劑雜交液 68 ℃；含有 50% 的甲酰胺的雜交液 42 ℃；磷酸 -SDS 雜交液 65 ℃）

3 ．如果放射性標記的探針是雙鏈 DNA ， 100 ℃加熱 5min 變性，迅速將探針放入冰水浴中冷卻。

4． 若要使探針與包含基因組 DNA 的膜雜交，請按照下列方法之一進行

在熱密封袋中進行的雜交

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a.?????? 迅速將裝有膜的塑料袋從水溶液中取出。用剪刀剪開一角打開袋子，將預雜交液倒出。

b.????? 將變性的探針加到適量的新鮮預雜交液中，并將溶液轉入袋子。盡量將袋中的空氣擠出。

c.?????? 用熱封口機重新密封袋子；使袋中盡量可能少地殘留氣泡。為了避免水浴的放射性污染，將重新封口的袋子密封于另一個未污染的袋子中。將袋子浸入適宜所需雜交階段溫度的水浴中。

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在雜交瓶中進行的雜交

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將預雜交液從雜交瓶中倒出并加入新鮮的含有探針的雜交液。 封好瓶口重新放入雜交爐。放置在適宜的溫度下。

?? 在塑料容器中進行的雜交

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將膜從容器中轉移到密封的袋子或雜交瓶中。 迅速按照上述方法處理。

5． 雜交后，洗膜。

在熱密封袋中進行的雜交

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a.?????? 帶上手套，將袋子從水浴中取出，去掉外層的袋子，迅速地將內層袋子剪去一角。將雜交液倒入處理放射性污染的廢液缸中，然后沿三邊將袋子剪開。

b.????? 將膜取出迅速浸入含有數百毫升 2 × SSC 及 0.5%SDS 的皿中（即每平方厘米膜約 1 毫升），室溫下將平皿放在緩慢的旋轉平臺上輕輕振蕩。

?? 在雜交瓶中進行的雜交

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將膜從雜交瓶中取出，夾住露出瓶口的膜的一角將多余的雜交液晾干。 將膜沒入含有數百毫升 2 × SSC 及 0.5%SDS 的皿中（即每平方厘米膜約 1 毫升），室溫下將平皿放在緩慢的旋轉平臺上輕輕振蕩。

6． 5min 后，將第一遍洗液倒入處理放射性污染的廢缸中，在皿中加入數百毫升 2 × SSC 及 0.1%SDS 。室溫下放置 15min 并輕輕振蕩數次。

7． 將浸泡的溶液換成數百毫升新鮮的含有 0.1% SDS 的 1 × SSC 。 65 ℃下放置 30min~4h ，并輕輕振蕩。

8． 室溫下用 0.1 × SSC 洗膜。

9． 將膜放在一疊紙巾上以除去大部分液體。將潮濕的膜放在一張 Saran 包裝膜上。在 Saran 包裝膜上取幾個不對稱的位置貼上用放射活性墨水（或磷光點）標記的黏性點標簽。這些標記物可以與膜一起進行放射自顯影。用 Scotch 膜覆蓋標簽。這樣可以避免污染顯影夾或使放射性墨水污染增感屏。

10．? 用 Saran 包裝膜覆蓋膜，放在增感屏內 -70 ℃用 X 線片曝光 16~24h 以獲得放射自顯影的圖像。

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